简介:摘要目的探讨微小RNA-146a(miR-146a)靶向调控信号转导与转录激活子1(STAT1)的表达,以及其在颈动脉粥样硬化(CAS)血管内皮细胞中的功能。方法将4月龄雄性新西兰白兔按随机数字表法分成4组,每组10只:假手术组(sham组)、模型组、miR-146a-mimics-NC组(对照组)和miR-146a-mimics组(实验组)。分别尾静脉注射LipofectamineTM RNAiMAX和miR-146a-mimics-NC、miR-146a-mimics的混合液到对照组和实验组兔体内,sham组和模型组注射等剂量的生理盐水;采用L-蛋氨酸饲料喂养配合颈总动脉球囊损伤法构建CAS模型,sham组只剥离颈内动脉,不进行球囊扩张和结扎。4周后处死动物留取标本,HE染色、qRT-PCR、Western blot检测各组兔CAS病理改变、miR-146a和STAT1蛋白的mRNA表达、Janus激酶2(JAK2)和磷酸化STAT1(p-STAT1)的表达水平。分别提取标本中颈动脉的血管内皮细胞进行培养,EdU标记、Transwell小室、小管形成、TUNEL染色检测各组细胞的增殖能力、迁移能力、小管生成能力和凋亡。荧光素酶报告基因分析miR-146a和STAT1的调控关系。结果与sham组相比,模型组兔颈动脉标本中miR-146a的表达水平明显降低,而STAT1的mRNA、JAK2和p-STAT1的表达水平明显升高,内皮细胞的增殖能力、迁移能力、小管生成能力降低,细胞凋亡率升高,CAS病理明显;与模型组和对照组相比,实验组兔颈动脉标本中miR-146a的表达水平明显升高,而STAT1的mRNA、JAK2和p-STAT1的表达水平明显下降,内皮细胞的增殖能力、迁移能力、小管生成能力增强,细胞凋亡率下降,CAS病理明显好转,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miR-146a与STAT1靶向结合。结论MiR-146a能靶向调控STAT1的表达,过表达miR-146a能够抑制STAT1的表达,发挥其保护颈动脉内皮细胞的功能。
简介:摘要目的观察微小RNA(miRNA,miR)-4295靶向调控多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法选取2018年6月到2020年4月经手术切除的120例脑胶质瘤及癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析胶质瘤组织和癌旁组织中miR-4295表达水平。采用慢病毒在脑胶质瘤细胞系U251建立miR-4295沉默细胞系(实验组)和对照细胞系(对照组)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖能力;采用Transwell分析细胞侵袭能力;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析对照组和实验组EMT标志物表达变化。生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-4295基因,并分析对照组和实验组细胞靶蛋白表达水平。组间数据比较采用t检验。结果与癌旁组织(1.29±0.20)比较,脑胶质瘤组织中miR-4295表达水平(2.81±0.19)显著增加,差异有统计学意义(t=2.809,P<0.05)。与对照组(1.07±0.15)比较,实验组细胞miR-4295表达水平(0.38±0.11)显著下调,差异有统计学意义(t=2.441,P<0.05)。与对照组细胞48 h吸光度(A)值(1.61±0.25)比较,实验组细胞48 h A值(1.22±0.18)显著下降,差异有统计学意义(t=2.091,P<0.05)。与对照组细胞[(89.27±9.10)个]比较,实验组侵袭细胞数量[(32.49±5.94)个]显著下降,差异有统计学意义(t=4.109,P<0.05)。与对照组细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达水平(1.13±0.13、1.20±0.19)比较,实验组细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平(0.30±0.11、0.37±0.12)显著下调,差异有统计学意义(t=3.091、2.861,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶报告基因显示LRIG1是miR-4295靶基因。癌旁组织中LRIG1相对表达水平(1.05±0.22)比较,肿瘤组织LRIG1相对表达水平(0.23±0.11)显著下调,差异有统计学意义(t=3.021,P<0.05)。与对照组细胞LRIG1相对表达水平(0.35±0.13)比较,实验组细胞LRIG1相对表达水平(0.89±0.17)显著增加,差异有统计学意义(t=2.198,P<0.05)。结论miR-4295通过靶向LRIG1调控着脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和EMT。
简介:摘要目的探讨微小RNA(miR)-643调控细胞色素P450家族成员11B1(CYP11B1)对小儿骨肉瘤增殖的临床与机制研究。方法收集2017年6月至2018年3月天津市天津医院收治的18例小儿骨肉瘤患者,年龄(12.04±2.68)岁,男12例,女6例,同期收集18例性别和年龄配对的健康儿童。应用Lipofectamine 2000介导转染细胞株,共分为五组:空载组,正常生长组,miR-643模拟物组,miR-643抑制剂组,CYP11B1抑制剂组,每组重复3次。实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-643相对表达量,蛋白质印迹法(Western blot)检测CYP11B1蛋白表达水平,细胞增殖与毒性(CCK-8)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,小鼠体内实验探究miR-643对肿瘤体积的影响。多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。结果与健康者(0.53±0.06)比较,骨肉瘤患者(3.24±0.81)血清miR-643表达水平显著增高(P<0.05)。在24、48、72 h时,与空载组[吸光度(A)值0.36±0.04、0.44±0.03、0.56±0.05]和正常生长组(0.35±0.06、0.45±0.04、0.58±0.07)比较,miR-643模拟物组(0.51±0.05、0.75±0.07、0.93±0.06)MG-63细胞的增殖能力显著增强(P<0.05),miR-643抑制剂组(0.24±0.05、0.28±0.06、0.33±0.06)增殖能力明显受到抑制(P<0.05)。与空载组[(7.65±0.47)%]和正常生长组[(7.80±0.51)%]比较,miR-643模拟物组[(3.12±0.22)%]MG-63细胞的凋亡能力显著下降(P<0.05),miR-643抑制剂组[(24.32±2.25)%]凋亡能力显著增高(P<0.05)。与空载组(1.04±0.06)和正常生长组(0.98±0.05)MG-63细胞CYP11B1蛋白水平比较,miR-643模拟物组(0.41±0.04)和CYP11B1抑制剂组(0.45±0.05)均显著下降(P<0.05),miR-643抑制剂组(1.64±0.13)显著增高(P<0.05)。皮下注射稳定转染sh-miR-643的MG-63细胞小鼠的肿瘤平均体积为[(621.74±38.63) mm3],显著低于对照组[(1104.36±57.01) mm3,t=4.017,P<0.01]。结论miR-643可促进骨肉瘤MG-63细胞增殖并抑制其凋亡,其机制与调控靶基因CYP11B1密切相关。
简介:摘要目的检测在结肠癌组织和对应癌旁组织微小RNA(miRNA,miR)-199a-3p和磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,探讨两者与结肠癌临床病理特征的关系。方法选择2016年1月至2019年7月武汉大学中南医院经病理学确诊的67例结肠癌患者,其中男性28例,女性37例,平均年龄63.2岁,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测其结肠癌组织及对应癌旁组织中miR-199a-3p和PI3K/Akt/mTOR表达,分析miR-199a-3p的表达与各临床病理学参数的关系,分析结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达之间的关系。应用SPSS 22.0统计软件分析,各组间比较采用χ2检验。结果结肠癌肿瘤组织miR-199a-3p表达(1.107±0.041)明显高于癌旁正常组织(0.613±0.034),差异有统计学意义(t=2.611,P<0.05);结肠癌患者肿瘤组织miR-199a-3p表达与淋巴管侵袭(χ2=8.111,P<0.05)、血管侵袭(χ2=5.550,P<0.05)、淋巴结转移(χ2=4.189,P<0.05)、肝转移(χ2=12.320,P<0.05)、临床分期(χ2=4.300,P<0.05)等临床病理因素明显相关,而与年龄(χ2=0.069,P>0.05)、性别(χ2=0.238,P>0.05)、肿瘤位置(χ2=0.321,P>0.05)、病理分级(χ2=0.013,P>0.05)、腹膜转移(χ2=0.109,P>0.05)等临床病理因素无明显相关;mTOR在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为80.60%(54/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率23.88%(16/67),差异有统计学意义(χ2=43.191,P<0.05);Akt在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为74.63%(50/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率28.36%(19/67),差异有统计学意义(χ2=28.711,P<0.05);PI3K在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为68.66%(46/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率25.37%(17/67),差异有统计学意义(χ2=25.191,P<0.05);结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p表达与PI3K、Akt、mTOR均呈正相关(r=0.632、0.605、0.689,P<0.05),结肠癌肿瘤组织中PI3K表达与Akt、mTOR均呈正相关(r=0.707、0.705,P<0.05),结肠癌肿瘤组织中Akt表达与mTOR呈正相关(r=0.647,P<0.05)。结论结肠癌患者肿瘤组织miR-199a-3p表达水平明显高于癌旁组织,与淋巴管侵袭、血管侵袭、淋巴结转移、肝转移、临床分期等临床病理因素显著相关;结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p、PI3K、Akt、mTOR表达之间均呈正相关,miR-199a-3p,PI3K/Akt/mTOR信号通路在结肠癌疾病发生、发展过程中发挥重要作用。
简介:摘要目的了解采用干扰素治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者干扰素受体(interferon-α receptor,IFNAR)、干扰素刺激基因因子3( interferon-stimulated gene factor 3,ISGF3)、双链RNA依赖蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase,PKR)、核糖核酸酶L(ribonuclease L,RNase L)的表达水平。方法纳入2014年7月至2017年6月南昌大学第一附属医院感染科收治的41例CHB初治患者,18例给予聚乙二醇干扰素α-2b治疗,23例患者给予普通干扰素治疗。采用反转录荧光聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测治疗前,治疗4、8、12、24周时患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L的mRNA和蛋白质表达水平。比较治疗有效组和无效组患者上述指标的表达水平。统计学分析采用t检验。结果治疗24周时,25例患者治疗有效,16例治疗无效。治疗4周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2和PKR的mRNA表达水平分别为0.748±0.129、1.169±0.125和1.047±0.091,分别高于无效组患者的0.591±0.021、0.689±0.059和0.791±0.033,差异均有统计学意义(t=-4.304、16.482、-5.346,均P<0.01);有效组患者PBMC中ISGF3和RNase L的mRNA表达水平分别为0.739±0.159和0.780±0.140,无效组患者分别为0.690±0.035和0.733±0.122,差异均无统计学意义(t=-0.160、-1.443,均P>0.05)。基线,治疗8、12和24周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA表达水平均高于无效组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。基线,治疗4、8、12和24周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的蛋白质表达水平均高于无效组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论采用干扰素治疗后,CHB患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA和蛋白质表达水平均可升高,其中IFNAR2和PKR在治疗早期(4周)即明显升高。
简介:摘要目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-454对食管癌细胞顺铂敏感性的影响及机制。方法将转染anti-miR-454、anti-miR-NC的ECA109细胞(中国科学院上海细胞库)设为anti-miR-454组、anti-miR-NC组。噻唑蓝(MTT)法检测顺铂对ECA109细胞增殖抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50);蛋白质印迹法(Western blot)实验检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达水平。多样本计量资料比较采用单因素方差分析,两两样本比较采用SNK-q检验。结果anti-miR-454组IC50值低于anti-miR-NC组[(0.41±0.05) μg/ml比(0.82±0.08) μg/ml,P<0.01];MTT实验显示,细胞中miR-454下调后,不同顺铂浓度对ECA109细胞增殖抑制率显著升高;Western blot实验显示,细胞中miR-454下调后,PI3K、mTOR、p70S6K蛋白相对表达量,p-Akt/Akt显著降低。结论下调miR-454表达可增强食管癌ECA109细胞顺铂敏感性,推测与其靶向上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达、抑制Akt信号通路有关。
简介:摘要目的研究高氧暴露和小分子干扰RNA(siRNA)对A549细胞中细胞核转录相关因子2(Nrf2)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)表达的影响,探讨其在高氧肺损伤中的作用及其与细胞凋亡的关系。方法将体外培养A549细胞随机分为4组:Ⅰ组为无干扰空气组;Ⅱ组为无干扰高氧组;Ⅲ组为Nrf2 siRNA转染空气组;Ⅳ组为Nrf2 siRNA转染高氧组;将Ⅱ组、Ⅳ组持续暴露于常压高浓度氧(950 mL/L O2,50 mL/L CO2)中;Ⅰ组、Ⅲ组仍置于50 mL/L CO2培养箱中。通过预实验从目的基因靶点siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3(分别加入对应脂质体复合物)中筛选出抑制Nrf2效率最高的Nrf2 siRNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、Western blot分别检测4组Nrf2、NQO1的mRNA及蛋白表达水平,应用免疫荧光和激光共聚焦显微镜分析干扰Nrf2后A549细胞中Nrf2、kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、抗氧化物反应元件蛋白的分布,观察各组细胞凋亡情况。结果1.Nrf2 siRNA可抑制Nrf2表达,siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组Nrf2 mRNA表达均被抑制,其中siRNA-1组的抑制效率最高(80.57%)。2.Ⅱ组Nrf2、NQO1 mRNA的相对表达量分别为4.553±0.498和5.866±0.582,与Ⅰ组相比,mRNA及蛋白表达量显著增高,细胞凋亡率[(21.67±0.75)%]增加,差异均有统计学意义(均P<0.01)。3.Ⅳ组Nrf2、NQO1 mRNA的相对表达量分别为0.937±0.057和0.789±0.058,与Ⅱ组相比,mRNA及蛋白表达显著减弱,细胞凋亡率[(35.83±0.42)%]进一步增高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论高氧暴露和siRNA导致A549细胞中Nrf2和NQO1表达异常,提示Nrf2和NQO1参与高氧肺损伤的发病过程;Nrf2、NQO1可能在高氧所致肺损伤及细胞凋亡中发挥保护作用。
简介:摘要目的探讨微RNA(miRNA)-181靶向磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用。方法选择雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组10只、模型组10只、阴性对照组10只和miRNA-181抑制组10只,检测大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮;采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理形态学改变;实时荧光定量(qRT)-PCR检测各组大鼠肾组织miRNA-181和PTEN、PI3K、Akt mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测各组大鼠肾组织PTEN、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181与PTEN的靶向关系。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐,进一步组间两两比较采用LSD-t检验;若方差不齐,进一步组间两两比较采用Tamhane′s T2检验;2组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组尿酸(135±21)mmol/L、肌酐(27.8±2.1)μmol/L、尿素氮(6.8±0.5)μmol/L相比,模型组和阴性对照组大鼠尿酸[(213±28)mmol/L,(214±23)mmol/L;肌酐(49.2±2.3)μmol/L,(48.6±2.2)μmol/L;尿素氮(11.5±2.7)μmol/L,(11.7±2.5)μmol/L]含量显著升高(F尿酸=26.739,F肌酐=259.055,F尿素氮=12.921,均P<0.05);与阴性对照组相比,miRNA-181抑制组大鼠尿酸(169±21)mmol/L、肌酐(33.7±1.8)μmol/L、尿素氮(9.1±1.7)μmol/L含量降低(LSD-t尿酸=4.356,LSD-t肌酐=15.773,LSD-t尿素氮=2.858,均P<0.05)。模型组和阴性对照组大鼠肾组织miRNA-181表达水平(1.88±0.16、1.84±0.18)显著高于对照组(0.53±0.08)(F=193.554,P<0.05),而PTEN蛋白(0.18±0.02、0.16±0.02)和mRNA表达水平(0.48±0.08、0.44±0.07)均低于对照组(1.27±0.06、1.27±0.16)(F蛋白表达水平=515.116,FmRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181后,大鼠肾组织肾组织miRNA-181表达水平(1.35±0.58)显著降低(LSD-t=10.341,P<0.05),PTEN蛋白(0.84±0.05)和mRNA表达水平(0.90±0.08)均升高(LSD-t蛋白表达水平=20.471,Tamhane′s T2 mRNA表达水平=13.881,均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,PTEN是miRNA-181的靶基因。与对照组(0.18±0.02、0.09±0.01、0.05±0.02、1.06±0.07、0.96±0.06)相比,模型组和阴性对照组大鼠肾组织PI3K(1.01±0.06、1.00±0.06)、Akt(0.90±0.05、0.95±0.04)、p-Akt蛋白表达水平(0.99±0.07、0.97±0.05)和PI3K(3.63±0.18、3.68±0.22)、Akt mRNA表达水平(2.38±0.05、2.34±0.12)均显著升高(FPI3K蛋白表达水平=169.979,FAkt蛋白表达水平=393.411,Fp-Akt蛋白表达水平=164.201,FPI3K mRNA表达水平=563.944,FAkt mRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181表达后,大鼠肾组织PI3K(0.69±0.06)、Akt(0.42±0.03)、p-Akt蛋白表达水平(0.50±0.05)和PI3K(2.40±0.09)、Akt mRNA表达水平(1.40±0.12)均降低(LSD-tPI3K蛋白表达水平=7.432,LSD-tAkt蛋白表达水平=18.291,LSD-tp-Akt蛋白表达水平=9.595,Tamhane′s T2PI3K mRNA表达水平=17.070,Tamhane′s T2Akt mRNA表达水平=17.357,均P<0.05)。结论抑制miRNA-181表达,可靶向PTEN抑制PI3K/Akt信号通路保护高尿酸血症大鼠肾损伤。
简介:摘要目的研究微小RNA-16-5p(miR-16-5p)对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting法)检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和骨肉瘤细胞MG63、Saos2、HOS内miR-16-5p、四分子交联体15(TSPAN15)mRNA和蛋白表达。在MG63细胞中转染miR-16-5p或si-TSPAN15,观察其在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移和侵袭,Western blotting法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TSPAN15、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达。Starbase网站预测结合双荧光素酶基因报告实验分析miR-16-5p与TSPAN15的靶向关系。将miR-16-5p和pcDNA-TSPAN1共转染,评估高表达TSPAN15对过表达miR-16-5p诱导的MG63细胞增殖、迁移和侵袭的影响。两组间数据的比较采用t检验。结果与hFOB 1.19细胞(1.00±0.12)相比,MG63、Saos2、HOS细胞中miR-16-5p表达量(分别为0.32±0.05、0.40±0.04、0.45±0.06)明显降低(F=156.204,P<0.05),TSPAN15 mRNA和蛋白水平显著提高(F=71.718、110.350,均P<0.05)。过表达miR-16-5p明显减少MG63细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量及细胞存活率、细胞迁移数量和侵袭数量(F=150.136、117.228、154.971、89.479、98.373、130.880,均P<0.05)。敲减TSPAN15明显降低MG63细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平、细胞存活率、细胞迁移数量和侵袭数量(F=93.206、107.030、109.326、115.625、146.113、139.300,均P<0.05)。过表达miR-16-5p显著降低MG63细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表达量(F=156.755、181.419,均P<0.05)。miR-16-5p靶向调控TSPAN15的表达。高表达TSPAN15可部分逆转miR-16-5p对MG63细胞内TSPAN15、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT蛋白表达、细胞存活率、细胞迁移数量和侵袭数量的抑制作用。结论miR-16-5p通过靶向TSPAN15基因并调控PI3K/AKT信号通路,从而抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。