简介：摘要目的掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP1（aa 1~200）和NP3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP2和NP2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。结论CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

简介：摘要目的探讨新疆出血热病毒（XHFV）糖蛋白的2个抗原优势区（GcⅠ和GcⅡ）以不同嵌合策略以及不同免疫方式诱导小鼠免疫应答的效果。方法以在5'端加入或不加鼠白细胞介素-2（IL-2）信号肽与通用型辅助性T细胞（Th）表位为不同设计策略，将GcⅠ、GcⅡ及GcⅠ上已鉴定出来的表位（Gc233~248、Gc241~256和Gc281~296）分别进行融合并构建至真核表达载体pVAX1与原核表达载体pET-28a上。采用间接免疫荧光法检测重组真核质粒的体外表达效果后进行大量提取，将重组原核质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达及纯化。通过基因免疫、蛋白免疫和DNA初免-蛋白加强免疫（联合免疫）3种方式免疫BALB/c小鼠，酶联免疫吸附测定法检测小鼠体内IgG抗体水平以及小鼠脾细胞培养上清中IL-4和干扰素-γ（IFN-γ）的含量，噻唑蓝比色法检测小鼠脾T淋巴细胞的增殖情况。结果双酶切及测序结果表明8种重组质粒构建成功。荧光显微镜下可见构建的重组真核质粒在体外细胞均能成功表达。3次免疫小鼠后，各实验组的小鼠血清IgG抗体水平和刺激指数均明显高于对照组（均P<0.01）。Th2型细胞因子IL-4与Th1型细胞因子IFN-γ的质量浓度检测结果表明，联合免疫组引起的免疫应答偏向Th1型。结论成功构建了XHFV糖蛋白的多表位嵌合疫苗且靶抗原在小鼠体内可有效表达，各免疫组与对照组相比均激发了较强的体液免疫及细胞免疫应答，其中pVAX1-ST（GcⅠe+GcⅡ）联合重组蛋白r（GcⅠe+GcⅡ）的免疫效果最好，有望作为XHFV的新型候选疫苗。

简介：摘要目的获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原，并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因，克隆至 pET32a（+）载体，构建重组表达质粒，转化至 BL21（DE3）。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原，建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法，并对其进行评价和初步应用。结果成功构建原核表达质粒pET32a-NP，重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，大小约为44 kD，Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性；检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。

简介：摘要目的原核表达古尔图病毒(Guertu virus, GTV)糖蛋白截短片段(Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2)，分别纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法分别扩增得到GTV DXM毒株截短糖蛋白Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2基因片段，并将其构建到原核表达载体pET-32a(＋)中，继而转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，SDS-PAGE分析蛋白质大小。经镍柱亲和层析纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白，用GTV阳性羊血清通过Western blot法检测重组蛋白的抗原性。用纯化的蛋白质分别免疫新西兰白兔制备抗血清，ELISA法检测血清效价。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2转染至哺乳动物Vero细胞，并用间接免疫荧光法评估前述制备的兔多克隆抗体的结合活性。最后用Western blot法检测血清与重组蛋白的特异性反应能力。结果双酶切鉴定和测序结果表明pET-32a-Gn、pET-32a-Gn1/Gn2/Gn3、pET-32a-Gc1/Gc2、pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2重组表达载体构建正确，重组表达蛋白Gn-His、Gn1/Gn2/Gn3-His、Gc1/Gc2-His相对分子质量(Mr)大小分别约为63.4×103、37.1×103、31.9×103、30.8×103、40×103和54.4×103。重组表达蛋白能够被GTV阳性羊血清所识别；获得的抗GTV Gn、Gc1和Gc2兔多克隆抗体效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶6 400。间接免疫荧光检测和Western blot结果表明制备的多克隆抗体能够与真核表达产物或重组蛋白发生特异性反应。结论重组GTV糖蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His得到了高效表达和纯化，具有较好的免疫性。制备的多克隆抗体效价高，特异性好。本研究结果为进一步开展GTV糖蛋白生物学功能及其检测方法和疫苗研究提供参考资料。