简介：摘要目的通过蛋白质组学、生物信息学、酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选脓毒症的差异表达蛋白，以期为脓毒症的诊断和预后判断寻找新的生物标志物。方法采用成组设计的实验方法，收集2019年1月至12月入住西南医科大学附属医院急诊科的脓毒症患者（脓毒症组）和同期在本院体检健康志愿者（健康对照组）的外周血标本；随机选取两组标本进行数据非依赖性采集模式（DIA）定量检测蛋白，利用生物信息分析方法对差异蛋白在转录水平进行基因本体（GO）功能富集、组间荟萃分析（Meta分析），并构建生存曲线；利用ELISA验证筛选出的指标，将数据与临床血清降钙素原（PCT）、C-反应蛋白（CRP）、血乳酸（Lac）数据共同构建受试者工作特征曲线（ROC曲线），筛选出对脓毒症证具有诊断及预后预测价值的生物标志物。结果DIA显示，脓毒症组有71个差异蛋白，6个下调、65个上调；这些差异蛋白的GO功能富集于细胞因子介导的信号通路应激反应、炎症反应、白细胞迁移等。组间Meta分析发现，转铁蛋白受体CD71表达在脓毒症组较健康对照组高〔标准化均数差（SMD）＝-0.47，95%可信区间（95%CI）为-0.93~0.00，P<0.01〕，在死亡组表达较生存组高（SMD＝-0.44，95%CI为-0.70~-0.18，P＝0.63）。生存曲线分析显示，CD71的表达与生存预后呈负相关，低表达者生存率越高（P＝0.000 34）。ELISA显示，脓毒症组CD71表达较健康对照组明显升高（nmol/L：156.83±84.71比87.99±47.89，P<0.05），死亡组CD71表达较生存组明显升高（nmol/L：219.63±125.59比130.97±40.45，P<0.05）。ROC曲线分析显示：CD71预测脓毒症的ROC曲线下面积（AUC）＝0.790（敏感度为65.1%，特异度为90.0%）；CD71预测脓毒症患者预后的AUC＝0.744（敏感度为57.1%，特异度为94.1%）；提示CD71对脓毒症的诊断和预后判断能力均强，且预后判断能力优于PCT（AUC＝0.547，敏感度为64.3%，特异度为55.9%）、CRP（AUC＝0.594，敏感度为64.3%，特异度为61.8%）和Lac（AUC＝0.540，敏感度为42.9%，特异度为82.4%）。结论CD71对脓毒症有较好的诊断和预后判断价值，具有作为脓毒症生物标志物的潜力。

简介：摘要目的对脓毒症患者进行蛋白质质谱分析，寻找脓毒症诊治的潜在新靶点。方法采用横断面观察研究方法，纳入2019年1月至12月在西南医科大学附属医院急诊科急诊重症监护病房（EICU）就诊的12例脓毒症患者及同期9例健康体检者。采集两组受试者外周血进行蛋白质质谱分析，并采用非依赖性采集技术得到各蛋白表达数据。将所得数据导入整合差异表达和通路分析在线网络工具IDEP2，对数据进行ID转换，并进行均一化处理，验证其可比性，再用主成分分析剔除离群数据。以P<0.05、log2差异倍数（FC）>1或log2FC<-1为差异有统计学意义，筛选出差异蛋白。用DAVID在线网站将筛选出的差异蛋白进行基因本体（GO）分析，从蛋白质的生物过程、细胞组分、分子功能3个方面对蛋白进行富集分析，同时进行京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）通路分析。通过基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING）在线网站进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，找到紧密联系的相关蛋白。结果两组数据经均一化处理后提示具有可比性。最终共筛选出125个差异蛋白，其中99个上调，26个下调。GO富集分析显示，筛选出的差异蛋白主要分布在细胞外，具有细胞调节功能及催化活性，参与生物调节、代谢过程及免疫过程；KEGG通路分析提示这些蛋白参与了氨基酸、糖类代谢及免疫相关通路。PPI分析显示，关键蛋白主要为基质金属蛋白酶14（MMP14）、纤维蛋白1（FBLN1）和血浆激肽释放酶1（KLKB1）等，最终筛选出与炎症、免疫等紧密相关的MMP14及KLKB1，二者可能是早期诊治脓毒症的潜在新靶点。结论MMP14和KLKB1可能为脓毒症诊治及预后判断的潜在生物标志物。

简介：摘要目的寻找内毒素耐受（ET）的潜在关键基因，为脓毒症的治疗提供理论和实验依据。方法①实验1（基因芯片与生物信息分析）：从基因表达数据库（GEO）中下载ET相关基因数据集GSE47783，该数据集由脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞建立脓毒症模型（LPS组）和ET模型（ET组）后进行实验获得；利用IDEP 0.92软件筛选数据集中两组差异表达基因（DEG），同时进行基因本体（GO）分析，并定位DEG主要富集的功能和信号通路。利用基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING），针对DEG构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选出核心基因甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2（HAVCR2）进行后续验证研究。②实验2（小鼠巨噬细胞株RAW264.7模型制备）：体外培养RAW264.7细胞，通过LPS刺激制备ET模型（ET组，用10 μg/L的LPS培养24 h后，再用100 μg/L的LPS培养4 h）和脓毒症模型（LPS组，用100 μg/L的LPS培养4 h）；磷酸盐缓冲液（PBS）组给予等体积溶媒PBS培养4 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测细胞HAVCR2的mRNA及蛋白表达。③实验3（HAVCR2慢病毒载体转染RAW264.7细胞）：为进一步明确HAVCR2是否参与ET形成，用慢病毒短发夹RNA（shRNA）技术敲低RAW264.7细胞中的HAVCR2后，再制备ET模型（HAVCR2--ET组），并设非敲低HAVCR2的对照组（ET组）。采用RT-qPCR法检测细胞中巨噬细胞极化关键基因〔精氨酸酶1（ARG1）、CD206、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮合酶2（NOS2）〕的mRNA表达。结果①实验1：共获得1 013个DEG；与LPS组比较，ET组有521个上调基因，492个下调基因；这些DEG的功能主要为增加生物合成、抑制炎症反应，主要富集于Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）、NOD样受体、Toll样受体（TLR）、TNF、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。选择ET组第一个表达上调的膜蛋白HAVCR2作为验证研究的目标。②实验2：体外实验结果显示，经大剂量LPS处理后，RAW264.7细胞中HAVCR2 mRNA表达较PBS组明显下调；而ET组HAVCR2 mRNA表达明显高于LPS组（2-ΔΔCT：1.10±0.10比0.60±0.10，P<0.05）；Western blotting检测结果与RT-qPCR结果一致。③实验3：与ET组相比，HAVCR2--ET组细胞ARG1和CD206的mRMA表达明显降低〔ARG1 mRNA（2-ΔΔCT）：0.50±0.10比1.00±0.10，CD206 mRNA（2-ΔΔCT）：0.73±0.10比1.00±0.10〕，下游因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达明显升高〔TNF-α mRNA（2-ΔΔCT）：2.20±0.10比1.00±0.10，IL-1β mRNA（2-ΔΔCT）：9.00±0.10比1.00±0.10〕，差异均有统计学意义（均P<0.05）；两组NOS2 mRNA表达差异无统计学意义。结论HAVCR2参与脓毒症下游炎性因子的调节，参与ET的形成，有望成为脓毒症新的治疗靶点。

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