简介：摘要目的评价不同体细胞来源的人诱导多能干细胞(hiPSCs)向3D视网膜类器官分化的能力。方法采用血液细胞重编程获得的hiPSCs系绿色荧光蛋白(GFP)标记的BC1细胞(BC1-GFP)及Gibco、尿液细胞重编程获得的hiPSCs系UE017进行视网膜诱导分化。光学显微镜下记录视网膜形态的发生和发展过程，采用免疫荧光染色法检测获得的视网膜中各种细胞亚类的特异性分子标志物表达情况，对不同细胞系分化视网膜的效率进行分析和比较。结果血液和尿液细胞来源的hiPSCs均可成功诱导分化为3D视网膜类器官，包括神经视网膜和视网膜色素上皮细胞。视网膜类器官能够模拟体内视网膜的发育过程，逐渐分化出所有神经视网膜亚类细胞，包括视网膜神经节细胞、光感受器细胞、无长突细胞、水平细胞、双极细胞和Müller细胞，甚至形成板层状结构。2种体细胞来源的hiPSCs在分化为视网膜类器官的效率上存在差异，血液来源的细胞比尿液来源的细胞分化为视网膜类器官的效率更高。结论血液和尿液体细胞来源的hiPSCs均可诱导出3D视网膜类器官，获得的视网膜类器官中包括所有视网膜细胞亚类，但2种体细胞来源的hiPSCs分化成视网膜类器官的效率不同。

简介：摘要目的构建表达视觉系统同源框2(VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1-VSX2eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1-VSX2eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。