简介：摘要目的验证lncRNA AC119762.8-201在乙烯硫脲(ethylene thiourea，ETU)诱导的大鼠胚胎肛门直肠畸形(anorectal malformation，ARM)中的差异表达；研究干扰及过表达lncRNA AC119762.8-201后对大鼠小肠隐窝上皮细胞株(intestinal epithelial cell line，IEC-6)的细胞增殖、迁移(上皮-间质转换)及Wnt5a蛋白表达水平的影响。方法选用体重250～300 g的健康成年未育的Wistar大鼠30只，其中雌鼠24只，雄鼠6只；雌雄大鼠按4∶1的比例于晚上合笼过夜，次日晨雌鼠做阴道涂片，在光镜下见到精子或阴道栓即确认已交配，当日为孕0 d(E0)，选取明确受孕的18只雌鼠按随机数字表法随机分为大鼠ETU-ARM致畸组(9只)和大鼠生理盐水对照组(9只)。孕10 d(E10)时，将大鼠ETU-ARM致畸组一次性灌胃注入1% ETU(125 mg/kg)，大鼠生理盐水对照组灌入等量生理盐水。在孕16 d(E16)、17 d(E17)和19 d(E19)，对两组孕鼠剖宫并取出胎鼠。无菌操作下，从大鼠ETU-ARM致畸组中共取得162只胎鼠，根据肉眼及解剖显微镜下观察，若胎鼠出现无尾或短尾畸形，且肛门与外界不相通，直肠末端与尿道之间有瘘管连通，则纳入胎鼠ARM组(简称ARM组)，ARM组共122只致畸胎鼠，致畸率为75.31%(122/162)；从大鼠生理盐水对照组取得141只胎鼠，胎鼠尾部均正常，无肛门直肠畸形，肛门与外界相通且直肠末端与尿道之间无瘘管连通，为胎鼠正常组(简称正常组)。解剖显微镜下，在无菌条件下取出ARM组和正常组胎鼠的直肠末端组织置于-80℃冰箱保存备用。采用实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测lncRNA AC119762.8-201的表达；提取IEC-6细胞质和细胞核RNA，通过qRT-PCR检测lncRNA AC119762.8-201在细胞中的定位；采用siRNA序列或过表达质粒转染的方法下调或上调IEC-6细胞中lncRNA AC119762.8-201的表达，通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)法检测细胞增殖，蛋白质印迹法检测细胞上皮-间质转换及Wnt5a蛋白表达水平的影响。结果通过qRT-PCR验证lncRNA AC119762.8-201在ARM组及正常组胎鼠肛门直肠组织中的表达水平；结果显示在E16、E17及E19时，与正常组相比，lncRNA AC119762.8-201的表达水平分别为(0.47±0.02比1.01±0.08，0.80±0.16比1.00±0.02，0.41±0.06比1.02±0.09)，lncRNA AC119762.8-201在ARM组中的表达水平下降，并且在E16和E19，ARM组及正常组之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。通过qRT-PCR验证lncRNA AC119762.8-201在IEC-6细胞质及细胞核中的表达水平。结果提示lncRNA AC119762.8-201在IEC-6细胞中有表达，且在细胞质(1.01±0.08)及细胞核(1.01±0.05)中均存在表达，差异无统计学意义(P>0.05)。在转染干扰si-RNA(si-NC和si-lnc)和过表达质粒(over-NC质粒和over-lnc质粒)对lncRNA AC119762.8-201表达水平的影响方面，转染si-RNA的结果显示，与转染si-NC的细胞(1.01±0.18)相比，转染si-lnc后，lncRNA AC119762.8-201的表达水平明显下调为(0.43±0.13)，差异具有统计学意义(P<0.05)；转染过表达质粒的结果显示，与转染over-NC质粒的细胞(0.98±0.02)相比，转染over-lnc质粒后，lncRNA AC119762.8-201的表达水平明显上调为(2 960.31±167.95)，差异具有统计学意义(P<0.01)。在lncRNA AC119762.8-201对细胞增殖的影响方面，结果提示当干扰lncRNA AC119762.8-201的表达时，细胞增殖能力呈下降趋势，6 h时的si-NC比si-lnc为(3.17±0.01比3.15±0.02)，差异无统计学意义(P>0.05)；12 h为(3.40±0.01比3.26±0.01)，差异具有统计学意义(P<0.01)；18 h为(3.55±0.01比3.35±0.05)，差异具有统计学意义(P<0.01)；24 h为(4.02±0.01比4.04±0.02)，差异无统计学意义(P>0.05)；相反，当过表达lncRNA AC119762.8-201时，细胞增殖能力呈升高趋势，6 h时的over-NC比over-lnc为(3.21±0.04比3.30±0.02)，差异无统计学意义(P>0.05)；12 h为(3.39±0.01比3.57±0.04)，差异具有统计学意义(P<0.01)；18 h为(3.59±0.01比3.69±0.03)，差异具有统计学意义(P<0.01)；24 h为(3.76±0.01比3.79±0.03)，差异无统计学意义(P>0.05)。lncRNA AC119762.8-201在干扰或过表达状态下对E-cadherin、β-catenin、N-cadherin及Vimentin表达水平的影响，蛋白质印迹法检测结果提示，当干扰lncRNA AC119762.8-201的表达时，转染si-NC后E-cadherin和β-catenin的表达水平明显低于转染si-lnc后的表达水平，转染si-NC与转染si-lnc后E-cadherin的表达水平相比为(0.32±0.01比0.57±0.04)，差异具有统计学意义(P<0.05)；转染si-NC与转染si-lnc后β-catenin的表达水平相比为(0.89±0.03比1.48±0.05)，差异具有统计学意义(P<0.01)；转染si-NC后N-cadherin和Vimentin的表达水平明显高于转染si-lnc后的表达水平，转染si-NC与转染si-lnc后N-cadherin的表达水平相比为(1.47±0.01比0.90±0.0 003)，差异具有统计学意义(P<0.01)；转染si-NC与转染si-lnc后Vimentin的表达水平相比为(2.02±0.03比1.02±0.02)，差异具有统计学意义(P<0.01)。相反，当过表达lncRNA AC119762.8-201时，转染over-NC后E-cadherin和β-catenin的表达水平明显高于转染over-lnc后的表达水平，差异均具有统计学意义(P<0.05)；转染over-NC后N-cadherin和Vimentin的表达水平明显低于转染over-lnc后的表达水平，差异均具有统计学意义(P<0.01)。lncRNA AC119762.8-201在干扰或过表达状态下对Wnt5a表达水平的影响，蛋白质印迹法检测结果提示，当干扰lncRNA AC119762.8-201的表达时，转染si-NC后Wnt5a的表达水平明显高于转染si-lnc后的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.01)；相反，当过表达lncRNA AC119762.8-201时，转染over-NC后Wnt5a的表达水平明显低于转染over-lnc后的表达水平，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论本研究通过动物模型验证了lncRNA AC119762.8-201在ARM组大鼠肛门直肠组织中的表达水平较正常组降低，其表达水平的降低可能会抑制细胞增殖、细胞上皮-间质转换及Wnt5a的表达，从而影响ARM的发生和发展。