简介:目的:构建压电基因传感器阵列检测系统。方法:首先利用精细微加工法制作单个传感器,在此基础上先后构建了粘胶式以及夹具式2×5型传感器阵列。并自行开发研制自激式振荡电路、PESAV2.0版频率记录分析软件。将它们与计算机联用以构建传感器阵列检测系统。结果:成功地制造出了在气、液相中稳定振荡的单个传感器,构建的粘接式及夹具式传感器阵列各有其优缺点;自激式振荡电路有非常强的振荡能力,在液相中起振非常容易,其频率稳定度也可达实用要求。PESAV2.0版频率记录分析软件具有自行设置各初始参数,实时记录频率变化、自动绘制频率变化趋势图及分析结果等多项功能。结论:成功地构建了传感器阵列检测系统,搭建起一个基因检测的技术平台,为临床上病原性微生物的检测以及多种疾病的早期诊断提供一种新方法。
简介:目的研究ELISA法定量测定钙调素(CaM)的最优条件。方法用重组人CaM、免抗CaM,通过对聚苯乙烯反应板进行紫外辐照处理,改善抗原因相化条件;通过对抗原包被液、包被时间等条件优化,建立简便、快速、准确的ELISA定量技术。结果以pH7.40.01mol/L的PB为包被液,包被及后续封闭时间为4℃静置72h,CaM包被浓度为5-8g/ml,抗原抗体反应时间为37℃60min,可获最佳CaM定量结果。结论建立的检测CaM的ELISA测定方法,敏感性、重复性均在临床检测可接受的范围内,标准曲线的线性也较好,可用于细胞内外CaM的定量研究。
简介:目的:建立一种灵敏度高、特异性好、精密度高、操作简便的荧光实时定量PCR技术,对临床标本中的TTVDNA进行定量检测。方法:设计针对TTV基因保守序列非转录区(UTR)的一对引物和一条荧光基团双标记探针。将PCR扩增所得的产物片段与PUCm—T载体连接并进行克隆,提取重组质粒以极限稀释法进行定量,作为定量检测的标准品。通过对重组质粒的测序来验证方法的特异性。通过与套式PCR—ELISA方法阳性检出率的比较,显示本方法学的高灵敏度。在临床研究中,通过对36例丙肝患者及123例不同血清标志物阳性的乙肝患者,166例健康体检者血清中TTVDNA的定量检测,评估TTVDNA在不同人群中检出阳性率的差异显著性。此外还观察了乙肝患者不同血清ALT水平组别TTVDNA阳性检出率的差别。结果:本方法检测TTV—DNA的灵敏度高于基于ORFl的普通套式PCR—ELISA方法,重组质粒测序结果显示方法有很好的特异性;通过重组质粒标本梯度稀释检测显示该方法的线性范围为10^2-7拷贝/ml;批间CV为13.2—16.0%,批内CV为6.5.0—11.3%。健康体检者、丙肝患者、乙肝患者三组人群的血清TTVDNA定量结果分别为10^4.11±0.97、10^3.91±1.07、10^3.89±0.99拷贝/ml;三组人群TTVDNA阳性检出率无差异显著性;且乙肝患者(TTVDNA+)血清ALT水平与TTVDNA载量无相关显著性(P>0.1);乙肝患者血清ALT异常与正常两组TTVDNA阳性检出率无差异显著性(P>0.1)。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性好、结果数据化,适合于临床实验室进行临床标本的TTV—DNA定量检测。
简介:目的:建立近似自然感染的丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)体外感染细胞模型.方法:将含10%HCVRNA阳性血清的接种液和HepG2细胞在37℃、5%CO2条件下共同孵育24h,再加含新生牛血清、地塞米松、胰岛素及硫酸亚铁的维持培养液,置32℃、5%CO2条件下培养,以后每3~4d传代一次,定期收集培养上清液和细胞.应用RT-nested-PCR、免疫组化及Westernblot进行病毒核酸和蛋白质的检测.结果:RT-nested-PCR法检测发现在接种病毒后第4~16天的细胞标本中可检测到HCVRNA正链,接种病毒后第4~24天的细胞标本则可检测到HCVRNA副链.通过免疫组化和Westernblot检测,病毒蛋白(NS3)能在第4天检出.结论:HCV体外感染HepG2细胞模型的建立,可望用于HCV吸附肝细胞机制研究及疫苗中和试验.
简介:目的建立SARS患者红细胞天然免疫粘附功能的快速检测方法,探讨天然免疫清除功能在评估SARS病情发展变化中的意义。方法红细胞天然免疫粘附功能快速检测方法:将lμl离心沉淀的红细胞和100μ1自身血浆与150μl定量的靶细胞混合,37℃水浴30min。1个结合5个或以上红细胞的靶细胞为一个粘附功能单位,计算粘附率。结果临床确诊为SARS的病人在收住院一周内其红细胞天然免疫粘附功能即不同程度地下降,并且随病情的加重持续降低,随病情好转开始回升,在完全恢复期出现一过性地高于正常人平均水平。随后稍有下降;死亡前病人的红细胞天然免疫粘附功能全部消失。结论红细胞天然免疫粘附功能快速检测方法操作简单、重复性和稳定性好,可作为临床动态观察SARS病情发展变化、疗效评估及预后判断的重要参考指标。
简介:目的:建立α-干扰素(IFN-α)信号传导蛋白和基因检测的方法.方法:收集慢性乙型病毒性肝炎、自愈性乙型肝炎病毒感染者、健康对照者的外周静脉血并分离外周血单核细胞(PBMC),建立EB病毒(EBV)转化的B淋巴细胞系.体外分别用不同浓度的IFN-α(0、100、1000、10000IU/ml)刺激细胞,用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)检测IFN活化的干扰素刺激基因因子3(ISGF-3)和γ-干扰素活化因子(GAF);设计特异的引物和探针,用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测IFN诱导抗病毒蛋白MxA、OAS1、PKR的相对表达.结果:成功建立了EBV转化的B淋巴细胞系.建立了EMSA检测ISGF-3和GAF转录蛋白的方法,用实时荧光定量PCR能够准确地检测样本中MxA、OAS1和PKR的表达.结论:建立了IFN信号传导蛋白和基因检测的方法,为进一步研究IFN治疗慢性乙型病毒性肝炎的疗效提供依据.