简介：目的:外泌体是活细胞分泌的来源于多囊泡体的膜性囊泡,其主要作用包括携带与运输。雪旺细胞是周围神经再生中非常优秀的种子细胞,但其迁移能力较差,影响修复效果.本文旨在探讨外泌体和雪旺细胞共培养是否可以促进雪旺细胞迁移.方法:本实验通过分离纯化人脐带干细胞外泌体和大鼠坐骨神经雪旺细胞并鉴定,随后将其共培养于Transwell小室观察雪旺细胞迁移率.结果:通过人脐带干细胞超高速离心法得到的外泌体高表达干细胞标志物CD44(92.2±3.6%)、CD73(99.1±0.6%),并且低表达单核细胞表面抗原CD14(0.5±0.06%)以及造血千细胞表面抗原CD34(0.4±0.07%),外泌体鉴定高表达CD81和CD9;雪旺细胞培养鉴定纯度达(92.3±2.7)%;均符合实验要求。通过Transwell小室实验发现外泌体可以明显促进雪旺细胞的迁移,并且具有一定剂量关系:结论:外泌体可以提高雪旺细胞的迁移能力,从而使雪旺细胞在组织工程领域中的应用产生巨大突破.

简介：目的:悬浮细胞的转染较贴壁细胞存在一定难度,用多聚赖氨酸包被的细胞培养板培养悬浮细胞使其贴壁,用脂质体2000按照贴壁细胞转染的方法转染悬浮细胞,提供一种高效的转染悬浮细胞的方法。方法:悬浮细胞Jurkat或CCRF-CEM培养于包被了0.1mg/mL多聚赖氨酸的细胞培养板,16h后洗掉未贴壁的细胞,用脂质体2000分别将pWPXLd质粒或靶向人ABL1基因的小干扰RNA(siRNA)转染细胞,24h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,鉴定质粒的转染效率,或用Western印迹鉴定siRNA的干扰效率。结果:pWPXLd成功转染2种细胞,siRNA成功抑制了ABL1的表达。结论:质粒和siRNA均能成功转染,提供了一种高效可行的转染悬浮细胞的方法。

简介：【目的】为持续有效防控白背飞虱,研究云南东部白背飞虱种群对常用5种杀虫剂的敏感性及药剂的田间防治效果。【方法】采用室内稻茎浸渍法测定白背飞虱种群对5种杀虫剂的敏感性,同期通过田间小区试验评价5种杀虫剂对白背飞虱种群的防治效果。【结果】与敏感种群比较,噻虫嗪、噻嗪酮、吡虫啉、吡蚜酮和毒死蜱对滇东白背飞虱种群的LC50分别为0.208、0.459、0.608、3.108、1.256mg·L-1,抗性倍数分别为2.2、10.4、5.6、6.5、5.3倍;白背飞虱对噻虫嗪无抗性,对吡虫啉、吡蚜酮和毒死蜱为低水平抗性,对噻嗪酮为中等水平抗性;5种杀虫剂药后1、5和10d对白背飞虱种群的田间防控效果均有显著差异。除了吡蚜酮外,其他药剂的防效均在80%以上,其中以吡虫啉和噻嗪酮的持续期较长,药后10d仍在90%以上;噻虫嗪和吡虫啉药后1和5d的防效达90%以上;吡蚜酮药效在供试药剂中防效最低,在64.88%~77.82%之间。【结论】滇东师宗白背飞虱种群对噻嗪酮为中等水平抗性,对吡虫啉、吡蚜酮和毒死蜱均为低水平抗性,对噻虫嗪无抗性,田间防控效果以吡虫啉和噻嗪酮为最好。建议滇东稻区可以使用吡虫啉和噻嗪酮药剂防控白背飞虱,注意控制吡蚜酮的使用次数与用量。

简介：目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ^0A549细胞系。方法:在含50ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ^0A549细胞系;采用MTT法测定ρ^0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ^0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35d的ρ^0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ^0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ^0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ^0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。

简介：目的:探讨尼古丁在诱导的小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生中的作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hoch.est33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬的发生;采用中性红摄取实验检测尼古丁处理后巨噬细胞的吞噬能力;通过攻毒实验检测尼古丁诱导的肺炎。结果:不同浓度尼古丁作用下PI染色的死细胞呈上升趋势;LC3BⅡ蛋白表达具有尼古丁剂量依赖性,并且1μmol/L的尼古丁能够增强LPS预刺激的MH-S细胞自噬发生。电子透射显微镜结果显示在1μmol/L尼古丁的作用下,细胞内自噬体数量增加;MH-S的中性红摄取能力与尼古丁浓度剂量呈负相关性;尼古丁能够诱导小鼠发生肺炎,并降低小鼠体重。结论:尼古丁能够增强肺泡巨噬细胞的自噬水平,并且可以诱导肺炎的发生,有助于进一步研究吸烟与肺炎的关系。

简介：目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。

简介：目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×10^3的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。

简介：目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10^8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。

简介：目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3~6s)升至10倍,200s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5~8s),并且回落更慢,300s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。

简介：【目的】薇甘菊颈盲蝽是入侵植物薇甘菊的天敌昆虫。CYP4家族基因在专食性昆虫与宿主植物的相互作用中发挥着极其重要的作用,探明其在不同部位的表达情况,可为薇甘菊生物控制提供科学依据。【方法】采用RACE技术克隆薇甘菊颈盲蝽CYP基因,实时荧光定量PCR检测其在不同部位的表达情况。【结果】PmCYP4C1基因全长1713bp,其中ORF长1500bp,共编码500个氨基酸,理论分子质量为57.44ku,无信号肽;与其他昆虫CYP4家族基因的同源性大于40%,与温带臭虫CYP的亲缘关系最近。该基因在雌、雄虫各部位均有表达,且都是足部的表达量明显地高于其他部位;雌、雄虫的表达差异在于雄虫翅膀中的表达量明显地高于触角和残体,但在雌虫中这3个部位的表达量无显著差异,且雄虫翅膀中的表达量显著地高于雌虫,是其2.37倍。【结论】薇甘菊颈盲蝽PmCYP4基因除参与代谢有毒物质外,其主要功能可能是编码与薇甘菊颈盲蝽运动相关的酶。

简介：目的:研究磷脂化修饰对重组人超氧化物歧化酶(SOD)进入人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)、人心肌细胞(HCM)能力的影响。方法:分别运用流式细胞术和蛋白印迹分析磷脂化修饰的超氧化物歧化酶(PC-SOD)和SOD与HCAEC、HCM的结合能力,并用激光共聚焦显微术分析修饰前后的SOD在细胞中的定位。结果与结论:磷脂化修饰可显著增强PC-SOD与细胞的亲和力,并可显著增强PC-SOD进入人冠状动脉内皮细胞和人心肌细胞的能力。

简介：【目的】随着香蕉枯萎病菌4号生理小种热带型(简称FocTR4))在云南的入侵、传播和蔓延,对云南的香蕉产业产生严重的威胁。通过实时荧光定量PCR分析蕉园定植香蕉后7个月内的土壤中枯萎病病原菌TR4含量动态变化,明确不同香蕉品种的大田抗性表现以及不同肥料的防控效果,为枯萎病的防控提供技术参考。【方法】选用巴西蕉、桂蕉1号、南天黄和自主选育的云蕉1号为供试品种开展田间试验,设置虾肽有机肥+虾肽特护+虾肽果叶康(简称:虾肽有机肥处理)、常规有机肥+微生物制剂(简称:微生物处理)和常规有机肥(简称:对照)3个处理,调查4个品种在4个时间段的枯萎病发病率和3种肥料的防治效果。【结果】在月平均枯萎病病原菌TR4含量均超过2000拷贝的土壤条件下,4个品种的发病率在3个施肥处理中均表现出差异性,南天黄、云蕉1号的发病率与其他2个主栽感病品种的发病率差异达显著水平;3种施肥处理间的发病率达显著差异,发病率从高到低表现为对照>虾肽有机肥处理>微生物处理。【结论】施用微生物制剂对降低枯萎病发病率起一定的作用。南天黄的抗病性较强,云蕉1号也表现出较强的抗性,但还有待进一步改良和提高抗性。

简介：大麦黄花叶病是我国长江中下游地区大麦种植区域的主要病毒病害,由大麦黄花叶病毒(BaYMV,Barleyyellowmosaicvirus)及大麦和性花叶病毒(BaMMV,Barleymildmosaicvirus)引起,自然条件下病毒寄生于禾谷多黏菌中,通过感染大麦根部导致病害发生。本研究通过分析RNA-seq数据,获得感染BaMMV后上调表达的基因HORVU1Hr1G069640(WRKY55)。荧光定量PCR分析发现WRKY55在感病品种中的表达水平极显著高于抗病材料,说明WRKY55参与到大麦感染黄花叶病的过程。WRKY55全长870bp,在415~594位核苷酸之间含有WRKY保守结构域,系统进化分析显示该基因位于独立的进化分枝。组织表达分析发现该基因主要在根部和幼嫩组织中表达,而其他成熟部位表达较少甚至没有。农杆菌介导的烟草亚细胞定位实验发现WRKY55位于整个细胞。酵母转录因子活性分析实验未检测到转录激活活性,酵母双杂交实验未检测到WRKY55与感病基因编码蛋白eIF4E和PDIL5-1存在物理相互作用。这些结果显示WRKY55参与到大麦黄花叶病感染。

简介：目的:探讨年龄对于复杂性急性StanfordB型主动脉夹层(ComplicatedacutetypeBaorticdissection,cABAD)患者预后的影响。方法:回顾性分析2010年1月至2017年6月急诊收治入院的156例cABAD患者的住院病例资料,将其根据不同的年龄、治疗方式(药物保守治疗、血管内介入治疗、传统手术治疗)及治疗结果进行分组,并在不同的年龄组进行分析。结果:本研究的患者平均年龄为52.46±11.72岁,45%的患者(n=70)大于65岁,55%的患者(n=86)小于65岁。小于65岁的患者有22.2%的患者(n=19)接受药物保守治疗J9.8%的患者(n=17)接受传统手术治疗、58%的患者(n=50)接受血管内介入治疗,大于65岁的患者有48.6%的患者(n=34)接受药物保守治疗、11.4%的患者(n=8)接受传统手术治疗、40%的患者(n=28)接受血管内介入治疗。小于65岁与大于65岁患者院内死亡率分别为12.8%与35.7%(P<0.007),接受血管内治疗分别为2%与28.6%(P=0.001),常规手术治疗分别为21%与37.5%(p=0.468),药物保守治疗分别为31.5%与41.7%(p=0.489)。年龄65岁或以上是多因素分析中住院死亡率的预测因子(OR=2.72;95%CI1.343-4.674;p=0.012)。结论:年龄265岁对于cABAD患者的预后具有显著的影响,血管内介入治疗可有效降低院内死亡率,但死亡率随着年龄的增长而升高。

简介：【目的】建立一种基于环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术,从植物罹病组织中直接检测3种常见的根结线虫,为根结线虫的监测和防治提供技术支持。【方法】分别采用3种根结线虫的种类特异性引物对所选择的根结线虫的DNA片段进行PCR扩增,扩增产物纯化、回收并测序。根据3种根结线虫的测序结果,针对种类特异区段,采用PrimerExplorerV4软件,分别设计3种根结线虫的LAMP引物。设计的引物组人工合成后,以提取的纯化种群线虫DNA为模板,分别进行引物组的特异性测试,筛选出分别针对3种根结线虫的最佳引物组。【结果】研究设计的3种根结线虫的LAMP特异性引物能够直接从植物根结中检测出南方、花生、爪哇3种常见根结线虫,LAMP快速检测体系为:dNTPS浓度为1mmol·L^-1,Mg2+的浓度为5mmol·L^-1,不添加甜菜碱,反应时间为45min。【结论】本实验建立的南方、花生、爪哇根结线虫LAMP快速分子检测方法,具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征,能够从罹病植物组织中快速准确地检测出南方、花生和爪哇根结线虫,具有极高的实践应用价值。

简介：目的:研究血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平与急性脑梗死(ACI)溶栓后出血转化(HT)的相关性及其预测意义。方法:选择2014年2月到2017年6月在承德医学院附属医院神经内科诊治的ACI患者130例作为研究对象。根据患者是否存在溶栓后HT将其分成HT组(65例)和NHT组(65例),两组均根据患者的实际病情给予个性化的治疗,对比两组患者实验室指标、血清MMP-9水平、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,随访6个月后,记录死亡人数及Barthel指数,并分析患者血清MMP-9水平与其NIHSS评分、Barthel指数、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TC)水平的相关性。结果:HT组LDL-C及TC水平均低于NHT组(P<0.05)。HT组患者在溶栓前、溶栓后3d、溶栓后7d的血清MMP-9水平、NIHSS评分均高于NHT组(P<0.05)。随访6个月后,HT组的死亡率高于NHT组,而Barthel指数低于NHT组(P<0.05)。根据Spearman法分析相关性发现,患者血清MMP-9水平与其NIHSS评分呈正相关,而与Barthel指数、LDL-C及TC水平呈负相关(P<0.05)。结论:血清MMP-9水平与ACI溶栓后HT具有紧密的关联,有助于更好地预测患者的病情及预后,临床上可考虑在治疗ACI溶栓后HT时监测MMP-9水平,从而获得更加精准的辅助性数据参考。