简介:摘要自主感光视网膜神经节细胞(ipRGCs)是除视杆细胞、视锥细胞以外的第三类光感受器细胞,位于视网膜内层,由于其内含黑视蛋白,故具备自主感光能力。瞳孔对光反应(PLR)主要由ipRGCs介导产生。ipRGCs可通过黑视蛋白直接感受光信号产生PLR,也可被来自视杆、视锥细胞的信号激活产生PLR。由于视杆细胞、视锥细胞和黑视蛋白产生的PLR各具特点,可采用不同强度和波长的光信号选择性刺激视杆细胞、视锥细胞和黑视蛋白,通过对产生的PLR进行分析可间接反映视杆细胞、视锥细胞和含黑视蛋白的ipRGCs的功能,这一方法称为彩色光瞳孔测量。现主要对ipRGCs介导PLR的通路、视杆/视锥细胞和黑视蛋白引起的PLR特点、彩色光瞳孔测量及其临床应用作一综述,希冀为相关眼科疾病的诊断及鉴别诊断提供新思路。
简介:摘要目的探究体外将人诱导多能干细胞(hiPSCs)定向分化成视网膜类器官(ROs)的进程并进行小鼠在体细胞移植。方法使用定向分化培养基使BC1-eGFP hiPSCs悬浮培养得到神经球,培养第7天时将神经球贴壁培养诱导出神经视网膜上皮结构,然后人工分离类视网膜结构悬浮培养,进一步定向诱导分化得到成熟的ROs。采用实时荧光定量PCR检测培养第0、7、15、21和30周标志基因的表达水平变化,采用免疫荧光染色法检测培养第8天、第15天、第15周、第21周和第30周标志基因的蛋白水平变化来鉴定诱导分化进程及效果。在体移植ROs实验中,首先破坏外界膜,然后将经消化的RO细胞悬液从角巩膜缘注射到Gnat1-/-小鼠视网膜下腔,细胞移植后5个月进行视网膜切片的免疫荧光染色检测植入细胞的存活情况、与宿主视网膜的整合以及进一步的成熟分化情况。结果形态学和免疫荧光染色结果显示,体外诱导hiPSCs早期形成的眼区细胞高表达神经视网膜上皮特异性标志物PAX6和SOX1,随后细胞可以表达视网膜祖细胞特异性标志物LHX2,集落外圈逐渐形成圆形透明马蹄状的类视网膜结构。机械分离并悬浮培养得到的ROs直径约为1 mm,类视网膜组织逐渐增厚并出现类视网膜色素上皮细胞。实时荧光定量PCR结果显示视网膜祖细胞标志基因VSX2表达在第7周即达峰值并持续高表达(F=168.30,P<0.01),视网膜前体细胞标志基因RCVRN在第7周也开始出现并逐渐高表达(F=271.60,P<0.01),感光蛋白基因RHO在第15周开始表达(F=95.02,P<0.01),而成熟感光细胞标志OPN1LW/MW的表达在第21周明显升高(F=40.57,P<0.01)。免疫荧光染色进一步检测到感光蛋白RHO在第30周达高表达状态。RO细胞移植后3周,自身带有绿色荧光的细胞成功在宿主小鼠的视网膜外核层中长期存活,移植后5个月植入细胞表达功能性光信号转导蛋白GNAT1。结论体外3D培养诱导hiPSCs生成ROs可成功地模拟人体内视网膜的发育过程,移植的RO细胞能在受体小鼠眼内长期存活,进入外核层并进一步发育成熟为类感光细胞。
简介:摘要目的研究氧自由基清除剂依达拉奉对视网膜脱离(RD)模型大鼠早期视网膜自噬的调控及感光细胞的保护作用。方法取51只成年雄性Sprague-Dawley大鼠进行RD造模,另取24只大鼠作为PBS注射组。造模组采用右眼视网膜下注射0.5%透明质酸钠的方法制作RD动物模型。将造模成功大鼠按照随机数字表法随机分为RD模型组和依达拉奉治疗组。依达拉奉治疗组造模后连续给予3 mg/kg依达拉奉腹腔内注射,每天2次,PBS注射组和RD模型组腹腔注射等容量0.9%氯化钠溶液。分别于造模后1、3、7 d处死动物并取材。收集眼内液并检测总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。Western blot法检测视网膜组织中超氧化物歧化酶2(SOD2)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、自噬相关基因4(Atg4)、微管相关蛋白质1轻链3(LC3)蛋白表达。全眼球石蜡切片TUNEL染色分析感光细胞凋亡情况。结果所有RD模型眼视网膜脱离范围均>60%。不同时间点各组眼内液中MDA含量和T-SOD活性总体比较,差异均有统计学意义(MDA:F分组=385.513,P<0.01;F时间=13.021,P<0.01.T-SOD:F分组=48.865,P<0.01;F时间=7.700,P=0.003);与PBS注射组相比,造模后1、3、7 d RD模型组和依达拉奉治疗组眼内液MDA含量显著升高,T-SOD活性显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与RD模型组比较,造模后1、3、7 d依达拉奉治疗组MDA含量显著降低,T-SOD活性显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与PBS注射组相比,RD模型组和依达拉奉治疗组造模后1、3、7 d视网膜中SOD2和Nrf2蛋白相对表达量显著升高,造模后1、3 d视网膜中Atg4、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与RD模型组比较,依达拉奉治疗组造模后1、3、7 d视网膜中SOD2相对表达量显著升高,造模后1、3 d视网膜中Nrf2蛋白相对表达量显著升高,造模后3 d视网膜中Atg4、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。PBS注射组各时间点未见明显阳性染色细胞,RD模型组造模后1、3和7 d均可见感光细胞TUNEL阳性染色细胞,视网膜caspase-3水平较PBS注射组显著升高,依达拉奉治疗组造模后1、3、7 d感光细胞凋亡指数及视网膜caspase-3水平均较RD模型组显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论采用依达拉奉每天2次腹腔内注射能明显提高RD大鼠视网膜的抗氧化能力,调控视网膜自噬,减轻RD早期感光细胞凋亡的发生。