简介:为获得快速生长的泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus),研究了泥鳅β-actin基因启动子介导的革胡子鲶(Clariasgariepinus)生长激素(growthhormone,GH)重组基因。采用PCR和RT-PCR技术克隆泥鳅β-actin基因近端启动子、3′-UTR及革胡子鲶GH基因编码区,构建一个长为2418bp的GH重组基因DPRK。首先,构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因的重组表达载体pAF(pβ-actinpromoter-EGFP),然后转染DF1真核细胞,同时经酶切线性化后显微注射到斑马鱼(Daniorerio)和泥鳅的受精卵中,以评价泥鳅β-actin启动子的启动活性。其次,将重组基因DPRK显微注射到泥鳅受精卵中。结果显示:泥鳅β-actin启动子能在DF1细胞、斑马鱼和泥鳅的受精卵中启动绿色荧光蛋白的表达;泥鳅的荧光表达率(78.44%)显著高于斑马鱼(29.62%);泥鳅受精卵显微注射DPRK20d后,在mRNA水平检测到GH基因的表达。这表明泥鳅β-actin基因近端启动子具有显著的启动活性,且重组基因DPRK能在泥鳅体内表达,为下一步泥鳅的基因工程育种奠定了理论基础。
简介:为了解新疆石河子地区猪呼吸与繁殖障碍综合征(PRRS)免疫抗体水平及其消长的规律,采集周边不同地区13个猪场共726份血清,采用间接ELISA方法检测PRRS免疫抗体水平并进行分析。结果显示,该地区PRRS免疫抗体阳性率平均为87.33%,免疫抗体阳性率超过80%的猪场占全部猪场的76.92%,同时,母猪、种公猪、育肥猪免疫抗体的整体水平均超过85%,而仔猪的免疫抗体水平较低,仅为71.11%。结果表明当地应用的PRRS疫苗的免疫原性较好,免疫效果确实;仔猪免疫抗体水平较低的具体原因尚不清楚。该结果可为进一步了解石河子周边地区猪场PRRS免疫抗体的现状,制定合理的治疗措施和免疫程序提供参考。
简介:出于对转基因作物中标记基因的安全性考虑,植物转基因育种中标记基因的删除将成为未来研究的热点之一。位点特异性重组系统之一Cre/loxP系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。为了利用Cre/loxP系统构建一种可调控的标记基因删除系统,本研究首先从拟南芥中克隆了逆境诱导型的启动子rd29A,同时从质粒pCre上克隆了Cre基因,构建了含有rd29A:Cre:Tnos表达元件的中间载体,将这一表达元件插入到另一植物双元表达载体pKsb中,最终构建了含有loxP-Pnos—nptⅡ-Toes—rd29A—Cre-Tnos-loxP的可诱导型删除标记基因nptⅡ的植物双元表达载体。
简介:建立了气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)检测留兰香、桂皮、薄荷和月桂叶中乙氧氟草醚、唑草酮、乙螨唑残留的分析方法。4种香辛料用超纯水饱和,乙腈提取,无水硫酸镁及氯化钠盐析,氨基/石墨化碳黑(NH2-Carb)固相萃取柱净化,多反应监测模式,气相色谱-串联质谱测定。结果表明:乙氧氟草醚在0.0025~2mg/L范围内,唑草酮和乙螨唑在0.01~2mg/L范围内,3种农药的进样质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系,r>0.99;乙氧氟草醚在0.025、0.5和2mg/kg3个添加水平下,在4种香辛料中的平均回收率在86%~112%之间,相对标准偏差(RSD)在2.4%~9.6%之间;唑草酮在0.2、0.5和2mg/kg3个添加水平下的平均回收率在87%~114%之间,RSD在2.4%~11%之间;乙螨唑在0.5、2和5mg/kg3个添加水平下的平均回收率在86%~116%之间,RSD在3.2%~11%之间。乙氧氟草醚、唑草酮和乙螨唑在4种香辛料中的定量限(LOQ)分别为0.025、0.2和0.5mg/kg。
简介:启动子是调控外源基因在植物体内表达的“开关”。随着植物转基因技术的广泛应用,无论是基础研究还是应用研究,人们希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内的表达,使目的基因的“开”和“关”、表达的“多”和“少”、在“何地”和“何时”表达等。能够听从人的指挥,以实现植物育种的分子设计。因此,快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究的热点和难点。本文在互补末端连接反向PCR(CELI—PCR)技术基础上建立起…种快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列的新方法。该方法利用CELI—PCR进行染色体连续步移,获取足够长的目的基因及其上游基因组DNA序列,再根据转录起始位点是目的基因转录本和启动子的分界点,其下游转录本中的外显于可通过RT-PCR扩增,而上游启动子序列则不能被RT-PCR扩增这一特点,借助RT-PCR进行cDNA连续步移,直到获得全长cDNA,确定启动子基因5’非翻译区的位置,进而精确定位转录起始位点。从而获取目的基因准确的启动子序列和全长cDNA序列。因此,建立在CELI,PCR基础上的RITIS技术,可绕过繁琐的构建cDNA库和5'-RACE等方法快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列。