简介:目的:构建带Myc标签的LC3B—PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B—PLA2融合蛋白,并应用LC3B—PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LCgB序列,与PLA2G]O拼接后插入pCMV—Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B—PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B—PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV—Myc—LC3B—PLA2真核表达质粒,LC3B—PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。
简介:[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。
简介:大环内酯类抗生素基因工程是近年来生物工程领域研究的一个热点,利用基因工程改造大环内酯类抗生素合成基因,已经合成了100多种"非天然”的天然化合物,为筛选新抗生素开辟了新的途径.本研究以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,先用PCR扩增出红霉素合成基因eryKR6两侧片段,再用重叠PCR将其拼接成去除KR6的约3.2kbDNA片段,并克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201.用PEG介导将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226原生质体.PCR鉴定和生物活性检测均显示pWHM2201已重组到红霉素合成基因位点.在无抗性R3M斜面上生长两代后,制备重组体原生质体,并涂R3M平皿.利用PCR筛选出KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M.
简介:<正>WeandothershavefirmlyestablishedthatsurfaceIgMreceptor(sIgM-R)crosslinkingwithantibodiestotheiheavychain(anti-i)leadstogrowtharrestandapoptosisinaseriesofwellcharacterizedB-celllymphomas.Thisrequiresablationofc-Mycproteinexpressionandtheconcomitantinductionofthecyclin-dependent-kinaseinhibitor,p27Kip1.Thesignalingmechanismsregulatingc-Mycandp27Kip1proteinexpressionarepoorlyunderstood.However,werecentlyestablishedthatsIgM-Rmediateddown-modulationofthePI-3Kpathwaydirectlyaffectedc-Mycandp27Kip1expressionandaccuratelypredictedgrowtharrest
简介:Uponencounteringtheantigen(Ag),theimmunesystemcaneitherdevelopaspecificimmuneresponseofenteraspecificstateofunresponsiveness,tolerance.TheresponseofBcellstotheirspecificAgcanbeactivationandproliferation,leadingtotheimmuneresponse,oranergyandactivation-inducedcelldeath(AICD),leadingtotolerance.AICDinBlymphocytesisahighlyregulatedeventinitiatedbycrosslinkingoftheBcellreceptor(BCR).BCRengagementinitiatesseveralsignalingeventssuchasactivationofPLCγ,Ras,andPI3K,whichgenerallyspeaking,leadtosurvival.However,intheabsenceofsurvivalsignals(CD40orIL-4Rengagement),BCRcrosslinkingcanalsopromoteapoptoticsignaltransductionpathwayssuchasactivationofeffectorcaspases,expressionofpro-apoptoticgenes,andinhibitionofpro-survivalgenes.ThecomplexinterplaybetweensurvivalanddeathsignalsdeterminestheBcellfateand,consequently,theimmuneresponse.
简介:组蛋白甲基化是参予细胞的过程的一个多样的数组的重要epigenetic现象并且被发现了与癌症被联系。几的Recentidentification嘘一demethylases证明了那嘘一甲基化是一个可逆过程。通过一条候选人途径,我们化学上有简历作为H3K27demethylase识别了JMJD3。进HeLa房间的JMJD3的Transfection引起了整齐的乙醇H3K27的特定的减小,但是没在di-和单音的甲基H3K27上有效果,或嘘H3K4和H3K9上的一离氨酸methylations。Theenzymatic活动要求JmjC域和被建议了为余因子绑定重要的保存组氨酸。试管内生物化学的实验证明那JMJD3directly催化demethylation。另外,我们发现JMJD3起来在前列腺癌症,和它的表示调整了在变形前列腺癌症是更高的。因此,我们作为能够把整齐的乙醇组从移开的ademethylase识别了JMJD3嘘一H3离氨酸27并且起来在前列腺癌症调整了。
简介:ApoptosisproducedinBcellsthroughFas(APO-1,CD95)triggeringisregulatedbysignalsderivedfromothersurfacereceptors:CD40engagementproducesupregulationofFasexpressionandmarkedsusceptibilitytoFas-inducedcelldeath,whereasantigenreceptorengagement,orIL-4Rengagement,inhibitsFaskillingandinsodoinginducesastateofFas-resistance,eveninotherwisesensitive,CD40-stimulatedtargets.SurfaceimmunoglobulinandIL-4RutilizeatleastpartiallydistinctpathwaystoproduceFas-resistancethatdifferentiallydependonPKCandSTAT6,respectively.Further,surfaceimmunoglobulinsignalingforinducibleFas-resistancebypassesBtk,requiresNF-κB,andentailsnewmacromolecularsynthesis.TerminaleffectorsofBcellFas-resistanceincludetheknownanti-apoptoticgeneproducts,Bcl-XLandFLIP,andanovelanti-apoptoticgenethatencodesFAIM(FasApoptosisInhibitoryMolecule).faimwasidentifiedbydifferentialdisplayandexistsintwoalternativelysplicedforms;faim-Sisbroadlyexpressed,butfaim-Lexpressionistissue-specific.TheFAIMsequenceishighlyevolutionarilyconserved,suggestinganimportantroleforthismoleculethroughoutphylogeny.InducibleresistancetoFaskillingishypothesizedtoprotectforeignantigen-specificBcellsduringpotentiallyhazardousinteractionswithFasL-bearingTcells,whereasautoreactiveBcellsfailtobecomeFas-resistantandaredeletedviaFas-dependentcytotoxicity.InadvertentoraberrantacquisitionofFas-resistancemaypermitautoreactiveBcellstoescapeFasdeletion,andmalignantlymphocytestoimpedeanti-tumorimmunity.
简介:<正>ThesusceptibilityofprimaryBcellstoFas(APO-1,CD95)-mediatedapoptosisisregulatedbysignalsderivedfromadditionalsurfacereceptors.CD40engagementproducesupregulationofFasexpressionandinducesmarkedsensitivitytoFas-inducedcelldeath,whereasBcellantigenreceptor(BCR)engagementinhibitsFaskillingandtherebyproducesFas-resistance,eveninotherwisesusceptible,CD40-stimulatedtargets.BCRsignalingforinducibleFas-resistancedevelopsoveraperiodof12hoursanddependson
简介:目的建立具有潮霉素(hygromycin)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE-Ins-human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层.方法通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入3T3细胞中,利用潮霉素的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定.结果经500μg/ml的潮霉素压力筛选后,获得了抗性细胞克隆.抗性3T3细胞的形态和生长速度与正常3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段.结论成功地培育了潮霉素抗性的3T3细胞,为进行目的基因(pTRE-Ins-human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础.
简介:Circulargenomes,beingthelargestproportionofsequencedgenomes,playanimportantroleingenomeanalysis.However,traditional2Dcircularmaponlyprovidesanoverviewandannotationsofgenomebutdoesnotofferfeature-basedcomparison.Forremedyingtheseshortcomings,wedeveloped3DGenomeTuner,ahybridofcircularmapandcomparativemaptools.Itscapabilityofviewingcomparisonsbetweenmultiplecircularmapsina3Dspaceoffersgreatbenefitstothestudyofcomparativegenomics.Theprogramisfreelyavailable(underanLGPLlicence)athttp://sourceforge.net/projects/dgenometuner.
简介:混合的系kinase(MLK3)3是被肿瘤坏死因素激活的激活mitogen的蛋白质kinasekinasekinase--伪(TNF-伪)并且明确地在TNF-伪刺激上激活c6月N终端kinase(JNK)。TNF-伪由激活MLK3的机制不被知道。TNF联系受体的因素(TRAF)是被招募到TNF受体的细胞质的结束并且调停的改编者分子,包括JNK的激活下游的发信号。这里,我们报导MLK3与TRAF2,TRAF5和TRAF6联系;然而,仅仅TRAF2能显著地导致MLK3的kinase活动。到TRAF领域并且为到它的C终端一半(氨基酸511-847)的MLK3的TRAF2地图的相互作用领域。与对方一起的内长的TRAF2和响应以一种时间依赖者方式的TNF-伪处理的MLK3伙伴。在MLK3和TRAF2之间的协会调停有绑在MLK3的TRAF2删除异种的MLK3激活和竞争以一种剂量依赖者方式稀释MLK3kinase活动,在TNF-伪处理上。而且MLK3的下游的目标,JNK被TNF-伪以一种TRAF2依赖的方式激活。因此,我们在TRAF2和MLK3之间的直接相互作用为TNF-伪-被要求的数据表演导致了MLK3和它的下游的目标的激活,JNK。
简介:在胸腺的中央忍耐是为删除汽车的主要机制反应T房间。尽管有这,进圆周的自我反应的T淋巴细胞的逃跑揭示汽车免疫的威胁。补偿它的瑕疵,胸腺也与镇压功能生产Foxp3+CD4+CD25+规章的T房间的一个自然地发生的子集,能够控制汽车反应房间。Foxp3(叉头框P3),为房间的这个子集的系特定的标记,对他们的thymic开发和外部功能关键,并且还Foxp3驾驶的transcriptional程序直到现在大部分未定义。新兴的证据提供了卓见进它的角色:从Foxp3到的能力与象NFAT那样的另外的抄写因素合作,到目标的染色体宽的描述,基因直接由Foxp3跳了并且调整。这里,我们讨论自然地发生的规章的T房间的发现-他们的显型,发展,维护,和功能-大部分当他们被系特定的标记定义,Foxp3。
简介:通过对树舌多糖进行荧光标记,解决多糖本身缺少易于检测发光基团的难题,为进一步研究多糖的生物学活性提供一种新型可靠的辅助手段。利用树舌多糖还原性末端与罗丹明B活泼的氨基发生反应,形成树舌多糖-罗丹明B复合物,再经流水透析和分子筛进一步纯化得到罗丹明B标记的树舌多糖。对树舌多糖与罗丹明B的反应时间、反应温度和pH进行了单因素考察。试验结果证明:罗丹明B可以有效的标记树舌多糖,在反应时间24h、pH5、温度25℃的条件下标记效果最好。在单因素试验的基础上对罗丹明B标记树舌多糖的条件进行响应面优化,最终得到罗丹明B标记树舌多糖的最优条件为:反应时间23.10h、温度25.83℃、pH5.23,预测标记后样品在552nm波长处的最大OD值为0.135。
简介:<正>Asoneofthemostcharacterizedcytokines,interleukin3(IL-3)iswellknownforitssurvivaleffectonbothprogenitorsandmaturebloodcells.Althoughwiththeextensivestudies,thesignalingpathwaysandunderlyingmechanismleadingtosurvivalresponsesofIL-3stillarenotcompletelyunderstood.Recently,anapoptoticgeneticpathwayofC.eleganswassuggestedtobeevolutionallyconservedinthatcontrolsthecytokine-dependentanti-apoptoticresponsesinmammalianhematopoieticcelllineages.Amongthispathway,Ces-2isknowntobethefirstdeathspecificationgeneintheC.eleganspathwayandencodesabZIPfamilytranscriptionalfactorthatsharesthesameDNArecognitionsequencewithanoncoprotein,