简介:摘要目的确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统,采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白,但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白,Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离(KD值=5.71×10-8和5.89×10-8 mol/L),rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4(KD值=6.4×10-9和3.2×10-9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时,上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高(P<0.05)。结论LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。
简介:摘要胚胎染色体异常是导致自然流产的重要因素之一,具体包括染色体数目异常和片段重复/缺失,均属于基因组拷贝数变异的范畴。流产物基因组拷贝数变异检测不仅能够检测流产物中的染色体数目异常,还能够检测其染色体片段的重复/缺失,进而揭示夫妇携带的隐匿性基因组结构变异,明确诊断,指导其选择再生育的方式和产前诊断,避免再次流产和生育染色体病患儿。在前期大量循证医学证据的基础上,经中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会遗传病防控学组、中华医学会医学遗传学分会临床遗传学组、中国医师协会医学遗传医师分会遗传病产前诊断专业委员会共同成立专家组,讨论并提出"流产物基因组拷贝数变异检测应用及家庭再生育咨询的专家共识",旨在为流产物基因组拷贝数变异检测应用和家庭再生育的遗传咨询提供指导。
简介:本研究探讨中药复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱、士的宁对人红白血病多药耐药细胞株K562/A02Mdr1基因及其表达产物P—gP的影响。采用噻唑蓝(MTT)法、台盼蓝拒染法检测上述药物的细胞毒作用;采用半定量RT—PCR和Westernblot分别检测上述4种中药在非细胞毒浓度(IC10)作用下对K562/A02细胞Mdr1基因及P—gP表达的影响。结果表明:复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱作用后,K562/A02细胞中Mdr1基因及P—gP表达降低(p〈0.01),其中马钱子碱组的作用最为显著;而士的宁作用后K562/A02细胞Mdr1基因及P—gP表达无明显变化。结论:复方当归注射液、马钱子碱、麻黄碱能部分逆转K562/A02细胞的耐药性,其作用机制主要与下调K562/A02细胞Mdr1mRNA的表达而导致细胞膜上P—gP的表达量减少有关。
简介:摘要目的探讨砷及其主要代谢产物对人肺腺癌细胞系A549细胞凋亡及促凋亡基因Bad和Bik表达的影响。方法于2020年10月,复苏培养A549细胞,利用细胞计数试剂CCK-8检测细胞活力,确定亚砷酸钠(NaAsO2)染毒A549细胞的浓度和时间。研究分为NaAsO2染毒组和代谢产物染毒组:NaAsO2染毒组染毒剂量为0(对照组)、20、40、60 μmol/L;代谢产物染毒组包括60 μmol/L一甲基胂酸(MMA)染毒组、60 μmol/L二甲基胂酸(DMA)染毒组。采用Hoechst33342/碘化丙啶双染法(Ho/PI)观察细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测染毒后细胞Bad和Bik mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Bad蛋白、磷酸化Bad(P-Bad-S112)蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白及下游蛋白多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP1)和细胞色素C(Cyt-C)的相对表达情况,采用分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)3、6、8、9的活性变化。结果与对照组比较,20、40、60 μmol/L NaAsO2染毒组凋亡细胞占比明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,2.0、4.0、6.0 μmol/LNaASO2染毒组Bad mRNA表达水平、Bik mRNA表达水平升高,Bad蛋白、磷酸化Bad蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白、PARP1蛋白、Cyt-C蛋白相对表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Caspase 3、6、8、9活性明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,DMA染毒组Bad mRNA表达水平为1.439±0.173,差异有统计学意义(P=0.024),Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.788);MMA染毒组Bad和Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.085、0.063)。与对照组比较,MMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.696±0.023、0.707±0.014、0.907±0.031、1.032±0.016)差异无统计学意义(P=0.469、0.669、0.859、0.771);DMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.698±0.030、0.705±0.022、0.908±0.015、1.029±0.010)差异均无统计学意义(P=0.479、0.636、0.803、0.984)。结论NaAsO2可通过引起Bad和Bik蛋白过表达,启动磷酸化Bad的负反馈调节以及Bik的降解,激活下游蛋白PARP1、Cyt-C和Caspase途径,介导A549细胞凋亡。
简介:目的:通过检测CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)基因的表达探讨糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSCs)脂向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞;成骨、成脂诱导人牙周膜细胞,对其进行干细胞鉴定。分别成脂诱导正常的人牙周膜干细胞和AGEs刺激下的人牙周膜干细胞,油红O染色观测两组细胞脂滴形成情况。实时定量聚合酶链反应(RealtimePCR)检测成脂诱导后AGEs刺激下C/EBPβ、PPAR-γ表达的改变。结果:牙周膜细胞成骨诱导21d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21d后油红O染色出现脂滴;AGEs刺激后人牙周膜干细胞成脂过程中脂滴的形成增多;RealtimePCR结果显示:AGEs刺激7d后C/EBPβ、PPAR-γmRNA表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(P〈0.05)。结论:AGEs可以促进人牙周膜干细胞的脂向分化并能改变C/EBPβ、PPAR-γmRNA的表达。