【摘要】 目的建立逍遥软胶囊的质量标准。方法采用薄层色谱( TLC) 法定性鉴别柴胡、白芍、当归、甘草;采用高效液相色谱(HPLC)法测定芍药苷、阿魏酸的含量。结果在TLC 色谱中均能检出柴胡、白芍、当归、甘草;芍药苷在51~340 μg·ml-1的范围内呈良好的线性关系,r= 0.999 9,平均回收率为98.2%, RSD=1.41% (n= 6) 。阿魏酸在41.6~208 μg·ml-1的范围内呈良好的线性关系,r= 0.999 9,平均回收率为100.5% ,RSD= 1.37% (n= 6) 。结论该法简便准确,可作为该制剂质量控制标准。
【关键词】 逍遥软胶囊 芍药苷 阿魏酸 高效液相色谱法
Abstract:ObjectiveTo establish the standard of Xiaoyao Capsula Mollis. MethodsRadix bupleuri, Radix Paeoniae Alba, Radix Angelicae Sinensis, Radix Glycyrrhizae in the preparation were identified by TLC; Paeoniflorin and ferulaic acid were determined by HPLC. ResultsRadix bupleuri, Radix Paeoniae Alba, Radix Angelicae Sinensis, Radix Glycyrrhizae could be identified by TLC. Paeoniflorin showed a good linear relationship at a range of 51~340 μg·ml-1,r = 0. 999 9,the average recovery of paeoniflorin was 98.2% , RSD was 1.41% (n= 6). Ferulaic acid showed a good linear relationship at a range of 41.6~208 μg·ml-1,r= 0.999 9,the average recovery of ferulaic acid was 100.5% , RSD was 1.37%(n=6). ConclusionThe methods are simple, accurate and reproducible.
Key words:Xiaoyao Capsula Mollis; Paeoniflorin; Ferulaic acid; HPLC
逍遥丸为汉·张仲景所著《伤寒论》中四逆散及《金匮要略》中当归芍药散之衍变方,可疏肝健脾、养血调经,临床多用于妇科疾病[1~2]。逍遥软胶囊是由逍遥丸剂型改革而来,本方由柴胡、白芍、当归、白术、茯苓、甘草、薄荷7味中药组成。为了控制本品的质量,本实验采用薄层色谱法对方中所含柴胡、白芍、当归、甘草等药味进行了薄层色谱鉴别,并采用高效液相色谱(HPLC)法测定了白芍、当归中的主要有效成分芍药苷、阿魏酸的含量。
1 仪器与试药
美国Waters公司2695型高效液相色谱仪,2996型紫外检测器,empower工作站。Milli-Q纯水器(密理博上海贸易有限公司)。硅胶G(青岛海洋化工厂)。逍遥软胶囊(自制)。柴胡等药材购自哈尔滨市药材公司,经黑龙江中医药大学生药教研室鉴定为《中国药典》正品。芍药苷对照品、阿魏酸对照品、甘草酸单铵盐对照品、柴胡皂苷a对照品、对照药材(购自中国药品生物制品检定所)。甲醇、乙腈(色谱纯);水(超纯水);其余为分析纯。
2 方法与结果
2.1 鉴别
2.1.1 柴胡的薄层鉴别取逍遥软胶囊适量,取出内容物,称取10 g于回流提取器内,加甲醇50 ml回流提取30 min,过滤,滤液挥干,加入2 %氢氧化钠水溶液15 ml超声溶解残渣。用20 ml水饱和正丁醇振摇萃取两次,分取正丁醇层,蒸干,残渣用甲醇溶解,定容至5 ml,作为供试品溶液。另取柴胡皂苷a对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液,作为对照品溶液。取对照药材、缺柴胡阴性对照品,同法分别制成对照药材、阴性对照溶液。取供试品溶液、对照品溶液、对照药材、阴性对照液各5 μl ,点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿甲醇水(30∶12∶1)为展开剂展开,两次展开后喷以对二甲氨基苯甲醛-95 %乙醇-浓硫酸(1∶100∶10)溶液,105℃烘5 min。供试品溶液、对照药材与对照品溶液相应位置上显相同颜色斑点,阴性对照液无此斑点,薄层色谱图见图1。
2.1.2 白芍的薄层鉴别取逍遥软胶囊适量,取出内容物,称取10 g,至回流提取器内,加甲醇50 ml回流提取30 min,过滤,滤液挥干,残渣溶于15 ml正丁醇液中,移入分液漏斗,加入20 ml正丁醇饱和水振摇萃取2次,分取正丁醇层,蒸干,残渣用甲醇溶解,定容至5 ml,作为供试品溶液。另取芍药苷对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液,作为对照品溶液。取对照药材、缺白芍阴性对照品,同法分别制成对照药材、阴性对照溶液。取供试品溶液、对照品溶液、对照药材、阴性对照液各5 μl ,点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿甲醇醋酸乙酯(10∶5∶1)为展开剂,在氨蒸气饱和下展开。取出晾干后喷以10% H2SO4乙醇液,100℃烘5 min。供试品溶液、对照药材与对照品溶液相应位置上显相同颜色斑点,阴性对照液无此斑点,薄层色谱图见图2。
2.1.3 当归的薄层鉴别供试品处理方法同“2.1.2”项。另取阿魏酸对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液,作为对照品溶液。取对照药材、缺当归阴性对照品,同法分别制成对照药材、阴性对照溶液。取供试品溶液、对照品溶液、对照药材、阴性对照液各5 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以乙醇丙酮氯仿冰醋酸(1∶4∶10∶1)为展开剂展开,取出晾干,喷以2%三氯化铁的50%乙醇溶液-2%铁氰化钾的50%乙醇液(1∶1)进行显色。供试品溶液与对照品溶液相应位置上显相同颜色斑点,阴性对照液无此斑点,薄层色谱图见图3。
2.1.4 甘草的薄层鉴别取逍遥软胶囊适量,取出内容物,取5 g于回流提取器内,加乙醚40 ml回流提取30 min,过滤,药渣加甲醇30 ml置水浴上加热回流1 h,滤过,滤液蒸干,残渣加水40 ml,使溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次20 ml,合并正丁醇萃取液,加入20 ml正丁醇饱和水振摇萃取2次,分取正丁醇层,蒸干,残渣用甲醇溶解,定容至5 ml,作为供试品溶液。另取甘草酸单铵盐对照品,加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液,作为对照品溶液。取对照药材、缺甘草阴性对照品,同法分别制成对照药材、阴性对照溶液。取供试品溶液、对照品溶液、对照药材、阴性对照液各5 μl ,点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿甲醇水(30∶12∶1)为展开剂展开,两次展开后喷以对二甲氨基苯甲醛95 %乙醇浓硫酸(1∶100∶10)溶液,105℃烘5 min。供试品溶液、对照药材与对照品溶液相应位置上显相同颜色斑点,阴性对照液无此斑点,薄层色谱图见图4。2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件C18色谱柱(220 mm×4.6 mm,5 μm)(大连物理化学研究所),流速1 ml·min-1,柱温30℃,芍药苷、阿魏酸的流动相均为甲醇水(1﹪HAC)(25∶75),芍药苷检测波长232 nm,阿魏酸检测波长323 nm。
2.2.2 标准曲线考察精密称取芍药苷对照品6.8 mg,置10 ml容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度。分别用微量移液管精密移取150,400,600,800,1 000 μl的对照溶液,置2 ml量瓶中,定容。精密称取阿魏酸对照品5.2 mg,置25 ml容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度。分别用微量移液管精密移取阿魏酸对照品溶液400,800,1 200,1 600,2 000 μl置2 ml容量瓶,定容,备用。HPLC进样10 μl,按含量测定方法测定峰面积,并以峰面积的积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标建立标准曲线,计算回归方程,芍药苷回归方程为:Y=2.37×106X-6.08×104(r=0.999 9),在51~340 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系。阿魏酸回归方程为:Y=1.01×107X-7.1×104(r=0.999 9),在41.6~208 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系。
2.2.3 样品的含量测定取本品10粒,剪开,倾出内容物,加入甲醇50 ml超声3 h后取续滤液10 ml,经0.45 μm滤膜过滤,滤液作为供试品溶液。分别精密注入芍药苷对照品溶液、阿魏酸对照品溶液、供试品溶液各10 μl,进行HPLC 测定。结果表明:供试品芍药苷峰、阿魏酸峰与对照品峰保持一致,且与其他组分可以很好地分离。用外标法计算芍药苷、阿魏酸的含量,色谱图见图5~8。表1 指标成分标准曲线方程(略)
2.2.4 精密度及重现性实验精密度实验:精密吸取对照品溶液10 μl,连续进样5 次,测定峰面积积分值,结果芍药苷、阿魏酸RSD值分别为1.41%,1.37%。重现性实验:取样品,按测定法进行5 次测定,结果芍药苷、阿魏酸RSD值分别为1.01%,1.33%。
2.2.5 回收率实验取供试品适量,精密称定,定量加入芍药苷、阿魏酸对照品溶液,按样品测定项下,测定峰面积,计算回收率。结果芍药苷的平均回收率为98.2%,RSD=1.41% (n= 6) 。阿魏酸的平均回收率为100.5%,RSD= 1.37% (n= 6) 。
2.2.6 样品测定用本实验测定方法对3 批逍遥软胶囊进行测定,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略)
3 讨论
逍遥丸中白芍的TLC 鉴别,一般采用中性氧化铝柱或聚酰胺柱处理[3],研究中发现不经此步骤处理也可以排除干扰。
关于逍遥软胶囊制剂质量控制的研究较多,然而通常只是对白芍、当归、甘草定性的较多[4,5],本实验同时研究了柴胡的定性分析条件,并同时对芍药苷、阿魏酸定量分析,能更好地控制制剂质量。
【参考文献】
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