夏至草醇提物干预实验性弥散性血管内凝血大鼠肺损伤的实验研究

(整期优先)网络出版时间:2019-04-07
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     作者:晁怀宇,张玉平,刘正泉,雷慧,杜舒婷,姜华

【摘要】    目的观察夏至草醇提物对高分子右旋糖酐(Dextran 500)致弥散性血管内凝血(DIC)大鼠肺损伤的干预作用。方法Wistar雄性大鼠20只,随机分为夏至草组(n=8)、模型组(n=6)和对照组(n=6)。静脉推注10%Dextran 500(10 ml/kg·体重)复制DIC模型(对照组以等量生理盐水代替)。6 min后,夏至草组自颈静脉缓慢推注夏至草醇提物(5 g/ml,6 g/kg·体重),其它两组以等量生理盐水代替。40 min后,制备肺组织匀浆,观察肺匀浆自由基指标MDA含量及SOD活性、NO含量及NOS活性的变化。结果与对照组相比,模型组肺组织匀浆MDA、NO含量及NOS活性显著升高,SOD活性降低;夏至草组肺组织匀浆MDA、NO含量及NOS活性显著低于模型组,SOD活性升高,各指标与对照组比较无统计学意义。结论夏至草醇提物减轻Dextran 500致DIC大鼠肺损伤的机制与降低自由基损伤、降低NO的生成与释放有关。

【关键词】  夏至草;弥散性血管内凝血;肺损伤;自由基;一氧

  Abstract:ObjectiveTo observe the effects of ethanol extract from Mrrubium incisum against lung injury of disseminated intravascuclar coagulation (DIC) rats induced by Dextran 500.Methods20 male Wistar rats were randomly pided into three groups: Mrrubium incisum group (n=8), model group (n=6) and control group (n=6). The DIC model was established by intravenous injection of Dextran 500 (10 ml/kg·bw), and Dextran 500 was replaced by equivalent normal saline in control group. 6 minutes later, ethanol extract from Mrrubium incisum was infused  (5 g/ml, 6g/kg·bw); in other groups ethanol extract from Mrrubium incisum was replaced by normal saline. After 40 min, the lung was taken out, the 10% tissue homogenate was prepared, and the free radical indexes of MDA content and SOD activity, NO content and NOS activity were determined.ResultsThe contents of MDA and NO and NOS activity of lung homogenate in model group were significantly increased, and SOD activity were significantly lower than that in control group. The contents of MDA and NO and NOS activity of lung homogenate in Mrrubium incisum group were significantly lowered, and SOD activity were significantly increased as compared with model group. There was no statistical difference between Mrrubium incisum group and control group. ConclusionEthanol extract from Mrrubium incisum can markedly abate lung injury of DIC rats by Dextran 500 and its mechanism may be related to scavenging free radical and decreasing NO release.

  Key words:Mrrubium incisum;  Disseminated intravascuclar coagulation (DIC);  Dextran 500;  Lung injury;  Free radical;  Nitric oxide

    弥散性血管内凝血(disseminated intravascuclar coagulation, DIC)是临床常见的危重病理过程,在此病理过程中所形成的微血栓、以及出血后引起的低血容量、微循环障碍等因素,是导致危重患者出现肺损伤甚至多个器官功能障碍的主要因素之一。因此,寻求合理的治疗措施防止DIC引起的肺损伤成为临床研究的重点内容。研究表明,高分子右旋糖酐(Dextran 500)在导致大鼠DIC及血液流变性异常的同时,可引起大鼠肝、肾、肺等多个器官组织形态学损伤,组织学观察可见红细胞淤滞、微血栓及细胞坏死等[1];夏至草可明显改善血淤大鼠的血液和淋巴微循环障碍[2,3],从而维持机体自稳态。为了进一步阐明夏至草醇提物干预DIC大鼠重要器官肺损伤的机制,本研究观察夏至草醇提物对Dextran 500致大鼠DIC肺组织自由基及一氧化氮(NO)的影响,为临床DIC致肺损伤的防治提供实验依据。

  1  器材与方法

  1.1  动物与分组

  Wistar大鼠20只,体重240~300 g(中国医科院实验动物繁育中心提供),随机分为夏至草组(n=8)、模型组(n=6)和对照组(n=6)。前两组复制DIC模型。

  1.2  药品与仪器

  唇形科夏至草属植物夏至草mrrubium incisum Benth的全草(内蒙驻张家口医药站提供,经河北北方学院中医系姜希强教授鉴定),按文献[4]报道方法,制备夏至草醇提物,经水煎醇沉,再经活性炭脱色、灭菌制成原生药含量为5g/ml的注射液(pH、澄清度、溶血试验检测均为合格);戊巴比妥钠(北京化学试剂厂生产,批号20000919);肝素钠(北京奥博星生物技术责任有限公司生产,批号001218);高分子右旋糖酐(Dextran 500,瑞典Pharmacia Biotech)。WZF-50F2双道微量注射泵(浙江大学医学仪器有限公司);FJ-200型高速分散均质机(上海标本模具厂)。

  1.3  DIC模型的复制及标本制备

  所有大鼠均以2%戊巴比妥钠溶液(50 mg/kg·体重)肌注麻醉后,行颈部正中手术切口,剥离左颈静脉和右颈总动脉,插管,备注射、输液及放血用。稳定15 min后,夏至草组及模型组大鼠,以10%的Dextran 500(10 ml/kg·体重)经左颈静脉缓慢匀速推注,1min注完,复制急性微循环模型[5,6]。6 min后,夏至草组经微量注射泵由颈静脉缓慢推注夏至草醇提物(6 g/kg·体重,以等量生理盐水稀释);模型组输入与夏至草醇提物等量的生理盐水;输液时间为5 min。对照组以等量生理盐水代替Dextran 500和夏至草醇提物。经夏至草醇提物治疗或相当于治疗40min后,分别处死动物。选择固定肺组织0.8~1.0 g,加9倍的4℃无菌生理盐水,应用高速分散均质机低温制备10%组织匀浆,应用高速低温离心机以2 500 r/min离心10min,取上清液置于冰箱内-80℃冷冻备测。

  1.4  指标检测应用

  改良硫代巴比妥酸(TBA)微量法测定肺组织匀浆丙二醛(MDA)水平、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,应用硝酸还原酶法、化学显色法分别检测各组动物肺匀浆NO2—/NO3—含量及NOS活性,严格按照试剂盒说明书要求进行操作(试剂盒购自南京建成生物工程研究所);匀浆蛋白以考马斯亮蓝法进行定量。

  1.5 统计学处理所有数据以±s表示,经SPSS 11.0统计软件包进行单因素方差分析。两组间比较用两样本均数t检验,P<0.05为具有显著性差异。2  结果

  2.1 夏至草醇提物对DIC大鼠肺组织自由基损伤的影响给予Dextran 500后,模型组肺匀浆MDA含量均显著高于夏至草组和对照组(P<0.01),而夏至草组与对照组比较无统计学意义(P>0.05);模型组肺匀浆SOD活性均显著低于对照组及夏至草组(P<0.01~0.05)。见表1。表1  夏至草醇提物对DIC大鼠肺匀浆MDA含量及SOD活性的影响(略)

  2.2 夏至草醇提物对DIC大鼠肺匀浆NO及其合酶的影响给予Dextran 500后,模型组肺匀浆NO2-/NO3-及NOS活性均显著高于夏至草组和对照组(P<0.01),夏至草组肺匀浆NO2-/NO3-含量及NOS活性与对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2  夏至草醇提物对DIC大鼠肺匀浆NO及其合酶的影响(略)

  3  讨论

    高分子右旋糖酐所导致的微循环障碍以及凝血功能紊乱,是引起心、肺、肾、肝等多个器官功能障碍、诱发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)甚至衰竭的主要因素之一[1]。临床上由于血液凝固性增强引起微血栓形成、进一步诱发肺内栓塞是导致肺损伤的主要原因,也是危重患者的致命因素之一。鉴于夏至草具有利水消肿、活血化淤作用[7],微循环障碍导致的缺血、缺氧是组织细胞损伤的重要因素,应用夏至草醇提物可明显改善大鼠的淋巴微循环障碍[8],为此,本研究从自由基损伤及一氧化氮等方面观察夏至草醇提物对DIC大鼠肺损伤的干预作用,在阐明夏至草药理学作用的同时,为临床防治DIC以及引起的肺损伤提供实验依据。


   
  研究结果表明,给予Dextran 500后,模型组肺匀浆自由基的代谢产物MDA含量显著升高,具有清除自由基功能的SOD活性降低,结果提示Dextran 500在引起大鼠DIC的同时,加重了肺组织细胞的缺氧以及酸性产物潴留,加之炎症反应增强,加速了自由基的生成,这是引起自由基产生和释放的重要原因[9]。过多的氧自由基进一步激活补体系统,补体活化产物刺激巨噬细胞和中性粒细胞释放细胞因子和氧自由基,后者进一步通过膜脂质过氧化作用攻击内皮细胞而加重损伤,形成自由基致细胞损伤的恶性循环,也证明自由基损伤在细胞损伤乃至器官功能障碍的发病学中具有重要作用[10]。输入夏至草醇提物后,肺匀浆MDA的含量显著低于模型组,SOD活性升高,结果提示输入夏至草醇提物有效地减轻了抑制肺组织细胞自由基的生成。 

  NO在参与调节血管和气管平滑肌舒张、机体免疫防御、细胞溶解等诸多方面发挥重要作用[11],降低NO的生成释放可改善内毒素休克的低血压[12]。研究结果也表明,给予Dextran 500后,模型组肺匀浆的NOS活性及NO含量增高,其机制可能为Dextran 500在引起大鼠急性微循环障碍的同时,加重了细胞缺氧,刺激iNOS活性表达增强,NOS活性增高,诱导内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞形成大量的NO,从而引起NO的释放增多;大量的NO发挥其损伤作用,加重炎症反应,通过刺激中性粒细胞产生呼吸爆发及脱颗粒,释放氧自由基和蛋白水解酶,作用于内皮细胞,进一步导致肺组织细胞损伤。输入夏至草醇提物后,肺匀浆NO含量及NOS活性均显著低于模型组,结果提示输入夏至草有效地抑制了NOS活性表达,从而减少NO的产生和释放。

  综上所述,夏至草醇提物对Dextran 500致DIC大鼠肺损伤具有较好的干预作用,其机制与夏至草醇提物具有良好的改善微循环流态[3]、改善细胞缺氧状态,从而减轻组织细胞的自由基损伤有关;同时,也抑制NO产生,减轻了NO所引起的炎症反应,降低NO对组织细胞的损伤,最终达到了保护细胞完整性的作用。研究结果为深入研究夏至草醇提物的药理学作用以及为临床DIC诱发肺损伤的防治提供了实验依据,具有较高的临床应用前景。

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