肝泰片质量标准研究

【摘要】 目的建立肝泰片质量标准。方法对珠子草、甘草进行薄层鉴别研究，并用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中没食子酸的含量。结果薄层图谱斑点清晰，阴性对照无干扰。没食子酸在4.16～41.6μg浓度范围内与峰面积呈线性关系，平均回收率为100.31%，RSD为0.69%（n=5）。结论结果准确，重复性好，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】 肝泰片 质量标准 没食子酸 高效液相色谱

肝泰片是由珠子草、黄芪、甘草等几味中药组成的复方制剂，具有舒肝利胆，清热解毒，扶正祛邪之功效，临床上用于乙型和丙型肝炎的治疗，取得了较好的疗效。为了增强对其质量的可控性，我们制订了对方中珠子草、甘草薄层鉴别方法，并采用HPLC法对珠子草所含没食子酸进行了含量测定。实验结果表明，本方法简便，专属性强，重复性好，可有效控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

岛津LC-10AVP高效液相色谱仪（包括SPD-10AVP二极管阵列检测器，LC-10AT二元泵）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；珠子草、甘草对照药材（中国药品生物制品检定所）；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0831-9501）；肝泰片（我院自制制剂，批号20050201，20050412，20050608）；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；CQX25-12超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；甲醇（色谱纯），重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 珠子草的薄层鉴别取本品内容物约1 g，加甲醇10 ml，超声处理10 min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取珠子草对照药材0.5 g，加甲醇10 ml，如上法操作，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录ⅥＢ）试验，吸取上述溶液各5 μl，分别点于硅胶G薄层板上，以环已烷－氯仿－醋酸乙酯(20∶5∶5)上行展开、取出、挥干溶剂，喷10％硫酸乙醇溶液，105℃烘5 min，日光下检视，样品供试液色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上有相同颜色的斑点,见图1。阴性对照液无干扰。

2.2 甘草的薄层鉴别取本品内容物约1 g，加稀乙醇10 ml，超声提取15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法（《中国药典》2005年版Ⅰ部附录ⅥＢ）试验，吸取上述两种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸（12∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点,见图2。阴性对照液无干扰。

2.3 珠子草中没食子酸的含量测定

2.3.1 色谱条件 ODS C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 检测波长:270 nm；流动相:A 甲醇，B 0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱条件：0～15 min，A-B（10:90），15～17 min，A-B（90:10），17～35 min，A-B（10:90）；流速1.0 ml·min-1； 柱温室温；进样量20μl。理论塔板数按没食子酸对照品计算大于5 000。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品30片，除去包衣，研细，精密称定，求得平均装量后，混匀，精密称取内容物适量（约500 mg），置25 ml容量瓶中，加入30%甲醇溶液约25 ml，称定重量，加热回流2 h，放冷，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液再经0.45 μm微孔滤膜过滤后，即得。 2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥至恒重的没食子酸对照品，加30%甲醇制成41.6 μg·ml-1的对照品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取不含珠子草的阴性样品,按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照液各20 μl，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果阴性对对照在没食子酸相应的保留时间处无干扰，色谱图见图3。

1.没食子酸对照品 2.阴性对照品 3.肝泰片样品

图3 高效液相色谱图

2.3.5 线性关系的考察 分别精密吸取上述没食子酸对照品溶液0.1， 0.2， 0.25，0.5，0.75，1.0 ml ，分别置25 ml容量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，摇匀，各进样20 μl，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=62 059.84X-35 650.77，r=0.999 9(n=6），结果表明没食子酸在4.16～41.6 μg浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.6 稳定性实验 取供试品溶液，分别于配制后0，2，4，8，12 h，依样品测定法测定，结果其峰面积积分值的RSD=0.90%，可见供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.7 精密度实验 精密吸取“2.3”项下对照品溶液20 μl，重复进样5次，测定其峰面积的RSD=0.60%。

2.3.8 重复性实验 取同一批号肝泰片，平行制备5份样品，按样品测定法测定，结果每片含没食子酸平均值为3.812 4 mg(RSD=0.65%，n=5)。

2.3.9 加样回收率实验 精密称取已知含量的同一批样品0.1 g,精确加入没食子酸对照品溶液适量(2.33 μg·ml-1),按样品溶液的制备方法操作,测定其含量,并计算平均回收率为100.31%，RSD=0.69%(n=5)。

2.3.10 样品测定 按样品测定方法测定3批样品，测定结果见表1。表1 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 提取条件的选择 为了选择样品的提取方法，本实验曾采取浸渍、超声法与加热回流法，结果表明以加热回流法提取的供品溶液没食子酸峰的峰面积较稳定，重现性较好。本实验对加热回流时间的进行了比较，样品在分别加热回流0.5，1，2 h，在同样条件下测定，结果加热回流2h的峰面积最大，故选择加热回流的时间为2 h。

3.2 流动相的选择 本实验选用ODS分析柱，曾用醋酸-水（2:98）、甲醇-0.005%磷酸溶液（2:98）、甲醇-0.025%磷酸溶液（15:85）、甲醇-0.008%磷酸溶液（5:95）、甲醇-0.01%磷酸溶液（10:90）、甲醇-水-磷酸（4:96:0.5）、甲醇-水-磷酸（20:80:0.5）、甲醇-水（77:23）、甲醇-水（70:30）、甲醇-水（60:40）进行试验，结果以甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相梯度洗脱，其分离效果最好，色谱峰形对称。在梯度洗脱时，经过多次摸索，以梯度洗脱法在32 min内可使全部色谱峰流出，且达到基线分离。