昆明山海棠提取物对移植物抗宿主病小鼠T细胞亚群的影响

【摘要】  　　[目的] 观察昆明山海棠(THH)提取物对移植物抗宿主病(GVHD)小鼠外周血T细胞亚群(CD+3CD+4、CD+3CD+8)的影响，探讨THH对GVHD的预防作用及机制。[方法] BALB/c受鼠(H2d)清髓性预处理后输注C57BL/6供鼠(H2b)骨髓细胞和脾细胞混合液，随机分4组：模型对照组、环孢素A(CsA)组(剂量为10mg·kg-1·d-1)、THH组(剂量为400mg·kg-1·d-1)、THH+CsA联合用药组(联药组，剂量为THH 100mg·kg-1·d-1+CsA 5mg·kg-1·d-1)。观察移植后受鼠GVHD发生及存活情况以及嵌合体植入情况;采用流式细胞术测定受鼠外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8 T细胞百分率。[结果]①CsA组、THH组、联药组受鼠生存时间均长于模型对照组(P<0.01);②CsA组、THH组、联药组受鼠GVHD临床表现和病理改变均较模型对照组轻;③模型对照组、CsA组、THH组、联药组受鼠骨髓细胞上异基因H2b百分率均>95%;④与模型对照组比较，CsA组、THH组、联药组受鼠移植后外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞百分率均下降(P<0.05)，CD+4/CD+8细胞比值均上升(P<0.05)，联药组变化最显著(P<0.05)。[结论] THH可通过调节CD+4/CD+8细胞比值，抑制T淋巴细胞免疫反应而预防小鼠GVHD，THH和CsA小剂量联合用药可能有协同作用。

【关键词】  昆明山海棠/药理学 移植物抗宿主病/中药疗法 T细胞亚群/血液 皮肤/病理学 肝脏/病理学

　　异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，alloHSCT)是一些血液系统恶性肿瘤的唯一治愈手段，但移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)严重降低了其成功率。GVHD的病理过程表现为来源于供体的T细胞识别受体抗原而致敏、增殖、分化并分泌多种细胞因子直接或间接攻击受体组织而发生的损伤性改变，CD+4T细胞和CD+8T细胞是参与GVHD的主要效应细胞[1]。临床常用的免疫抑制剂糖皮质激素、环孢素A(cyclosporin A，CsA)等可阻断T淋巴细胞的活化、增殖及应答，但其副作用大、费用高。因此，选择一种较温和的药物，既能减轻GVHD又不致使机体受到过多损伤，是亟待解决的问题。

　　昆明山海棠[Tripterygium hypolaucum(Level) Hutch，THH]是一种免疫抑制中药制剂，已用于多种自身免疫性疾病的治疗，有研究表明[2]其通过抑制T淋巴细胞的功能而发挥免疫抑制效应。本研究将其应用于异基因骨髓移植小鼠模型，观察其对GVHD的预防作用及对外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8T细胞的影响，为其进一步临床应用提供实验依据，现报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物 受鼠为BALB/c小鼠(H2d)，雌性;供鼠为C57BL/6小鼠(H2b)，雄性，均为清洁级近交系小鼠，鼠龄6～8周，体质量18～22g，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)20030003，按二级动物标准运输、饲养。

　　1.2 药物和试剂 CsA(杭州中美华东制药有限公司)溶于无菌生理盐水，配制浓度为1mg/mL;昆明山海棠片(广东博罗先锋药业集团有限公司，主要成分为二萜类和生物碱类，250mg/片)溶于无菌生理盐水，配制浓度分别为40、20、10mg/mL;小鼠抗H2Kb单抗(BD公司);异硫氰酸荧光素CD3(FITCCD3)、藻红蛋白CD4(PECD4)、藻红蛋白CD8(PECD8)单抗(eBioscience公司)。

　　1.3 GVHD模型复制 参照文献[3]方法无菌条件下制备骨髓细胞和脾细胞悬液，均调整细胞浓度为1×108/mL。受鼠移植前行全身照射(TBI)，照射源为60Co γ射线，总剂量8.0Gy，剂量率0.5Gy/min。照射后4h内经尾静脉输入含2×107个骨髓细胞和2×107个脾淋巴细胞的混合细胞悬液，观察GVHD发生情况。

　　1.4 THH和CsA药物剂量筛选 BALB/c受鼠随机分为6组，每组10只。每组受鼠均从移植前1d至移植后30d灌胃给药，每只0.2mL·d-1。模型对照组灌胃生理盐水0.2mL·d-1;THH高、中、低剂量组剂量分别为400、200、100mg·kg-1·d-1;CsA高、低剂量组剂量分别为10、5mg·kg-1·d-1。

　　1.5 实验动物分组 BALB/c受鼠随机分4组，每组20只，每组受鼠均从移植前1d至移植后30d灌胃给药。模型对照组灌胃生理盐水0.2mL·d-1，CsA组剂量为 10mg·kg-1·d-1，THH组剂量为400mg·kg-1·d-1，CsA+THH联合用药组(简称联药组)剂量为THH100mg·kg-1·d-1+CsA 5mg·kg-1·d-1。

　　1.6 主要观察和检测指标 移植后定期行外周血白细胞计数，观察各组受鼠临床表现(如弓背、翘毛、腹泻等)、生存时间(观察期50d);濒死小鼠死前取手足皮肤、肝脏和小肠，立即置于体积分数10%福尔马林溶液中，固定48h以上行病理检查，GVHD病理分级按Thomas标准[4]。采用流式细胞术分别检测移植后10、30d受鼠骨髓细胞上异基因H2b百分率和移植后5、10、15、20、30d受鼠外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8T细胞表达。

　　1.7 统计学方法 采用Stata7.0软件进行数据的处理。

　　2 结果

　　2.1 药物剂量筛选实验中不同剂量THH和CsA对移植后受鼠生存时间的影响 表1结果显示，THH高剂量组和CsA高剂量组受鼠生存时间较模型对照组显著延长(P<0.01)，THH中、低剂量组和CsA低剂量组受鼠生存时间虽较模型对照组有延长，但差异无显著性意义(P>0.05)，故选择THH 400mg·kg-1·d-1和CsA 10mg·kg-1·d-1作为THH和CsA实验组单药剂量，THH 100mg·kg-1·d-1+CsA 5mg·kg-1·d-1作为联药组剂量。

　　2.2 移植后各实验组受鼠GVHD发生及存活情况 表2结果显示，模型对照组受鼠移植后6d开始出现典型的翘毛、弓背、腹泻、体质量减轻等GVHD表现，20d内全部死亡;CsA组和THH组移植后8～9d开始出现GVHD表现，临床表现较轻，生存时间较模型对照组显著延长(P<0.01)，两给药组比较差异无显著性意义(P>0.05);联药组11d始出现不同程度的弓背、翘毛表现，生存时间较模型对照组显著延长(P<0.01)。模型对照组皮肤真皮层有不同程度的血管扩张充血、水肿、炎性细胞浸润，肝脏汇管区有充血、大量淋巴细胞和炎症细胞浸润，小肠局部肠黏膜细胞坏死、大量淋巴细胞炎症浸润，病理检查符合Thomas GVHD病理分级Ⅲ～Ⅳ级改变;CsA组和THH组存活小鼠仅肝脏汇管区或小肠有少量淋巴细胞浸润，符合Ⅰ～Ⅱ级GVHD病理改变;联药组存活小鼠组织病理学表现未见明显异常或仅小肠有少量淋巴细胞浸润，符合Ⅰ级GVHD病理改变(图1-图3)。表1 不同剂量THH和CsA对移植后受鼠生存时间的影响表2 各组移植后受鼠生存时间比较

　　2.3 移植后各实验组受鼠外周血白细胞变化及嵌合体检测结果 本实验测得正常BALB/c小鼠白细胞计数为(9.90±2.09)×109/L。移植后各实验组受鼠外周血白细胞总数均明显下降，移植后3d时各组白细胞总数降至最低点;移植后5d渐有升高趋势，移植后15～20d白细胞总数基本恢复到>6.00×109/L。移植后10d各组受鼠骨髓细胞表面H2b分子百分率均>95%，移植后30d CsA组、THH组和联药组受鼠骨髓细胞表面H2b分子百分率分别是(99.18±0.58)%、(97.68±0.59)%、(99.15±0.11)%，表明异基因骨髓细胞已经植入。

　　2.4 移植后各组受鼠外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8T细胞百分率比较 表3、表4结果显示移植后同一时间点CsA组、THH组和联药组受鼠外周血CD+3CD+4、CD+3CD+8T细胞百分率均较模型对照组下降(P<0.05)，其中联药组下降最明显，其次为THH组、CsA组(P<0.05)。联药组移植后20d CD+3CD+4、CD+3CD+8细胞百分率及移植后30d　CD+3CD+8细胞百分率均较CsA组、THH组显著降低(P<0.05)，CsA组与THH组两组间比较无显著性差异(P>0.05)。表5结果显示，各给药组CD+4/CD+8比值均较模型对照组升高(本实验测得正常BALB/c小鼠CD+4/CD+8比值为1.93±0.57)，联药组升高最显著(与CsA组、THH组比较，均P<0.05)。表3 各实验组移植后受鼠外周血CD+3CD+4 T细胞水平比较表4 各实验组移植后受鼠外周血CD+3CD+8 T细胞水平比较统计方法：单因素方差分析;①P<0.05，与模型对照组比较;②P<0.05，与CsA组比较;③P<0.05，与THH组比较表5 各实验组移植后受鼠外周血CD+4/CD+8 比值比较统计方法：单因素方差分析;①P<0.05，与模型对照组比较;②P<0.05，与CsA组比较;③P<0.05，与THH组比较3 讨论

　　昆明山海棠是我国特有的一种免疫抑制中药制剂，药源丰富，价格低廉。本品属于卫矛科雷公藤属植物，主要含有生物碱、萜类、甙类、有机酸、多糖等，其中二萜类和生物碱类是其主要活性成分，主要从根部提取得到[5-6]，免疫抑制功能亦与这两种活性成分有关。昆明山海棠片是THH根部的酒精提取物制成的片剂，其中生物碱含量不少于10mg/kg。

　　本实验选择C57BL/6→BALB/c小鼠异基因移植模型，受鼠在移植后1周左右白细胞开始上升，2周白细胞基本恢复至接近正常，移植后10d、30d流式细胞仪嵌合体检测显示受鼠骨髓细胞表面H2b分子百分率均>95%，表明异基因骨髓细胞已植入。模型对照组小鼠临床及病理均符合典型GVHD表现，20d内全部死亡，证明小鼠GVHD模型复制成功。

　　本实验在已建立的小鼠GVHD模型上，灌胃给予THH 400mg·kg-1·d-1后受鼠生存时间显著延长、GVHD临床和病理表现均较模型对照组减轻，说明THH有预防GVHD的作用。剂量筛选实验中THH 100mg·kg-1·d-1和CsA 5mg·kg-1·d-1受鼠生存时间无显著延长，但将两者小剂量联合应用后受鼠生存时间显著延长、GVHD临床和病理表现均较模型对照组减轻，表明THH和CsA小剂量联合用药可能有协同作用。

　　GVHD本质上是一种免疫应答过程，主要是T细胞介导的细胞免疫应答。移植物中供者来源的成熟T细胞被宿主异型组织相容性抗原激活，增殖分化为效应T细胞，激活的效应T细胞对宿主组织和器官发动免疫攻击，导致组织、器官功能受损甚至移植失败。CD+4T细胞中大部分是CD+4T辅助细胞，激活的CD+4T细胞分泌免疫应答发生必需的细胞因子，进而激活CD+8T细胞，使其成为细胞毒性T淋巴细胞，从而溶解供、受体细胞引发GVHD[7]。有研究[8]发现昆明山海棠甲素能促进外周血CD+4T细胞凋亡，也能诱导CD+8T细胞凋亡，因而应用昆明山海棠甲素后出现CD+4、CD+8T细胞数下降。本实验中发现应用THH后CD+4T细胞和CD+8T细胞表达均较模型对照组减少，提示THH预防GVHD的作用机制可能主要在于抑制T淋巴细胞的免疫反应。目前临床已有采用THH治疗多发性硬化、重症肌无力、糜烂性口腔扁平苔癣患者，其结果均可使外周血中CD+4/CD+8细胞比值较治疗前上升并接近正常[6]。本文研究结果也显示应用THH后CD+4/CD+8细胞比值较模型对照组上升，有向正常比例恢复的趋势。

　　本研究结果表明，THH在异基因骨髓移植小鼠模型中有预防GVHD的作用，可能与抑制T淋巴细胞的免疫反应、调节CD+4/CD+8细胞比值有关。THH和CsA小剂量联合应用可能有协同作用，有可能减少CsA的用量，减轻CsA的副作用并降低长期治疗费用，其联合协同作用机制有待进一步研究。

【参考文献】
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　　[2]唐瑛，陈大军，郑有顺.昆明山海棠胶囊对大鼠佐剂性关节炎T淋巴细胞的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2004，12(1)：7.

　　[3]徐开林，居建平，潘秀英，等.非清髓性异基因骨髓移植治疗小鼠白血病的实验研究[J].中华血液学杂志，2003，24(7)：372.

　　[4]何长民,石炳毅.器官移植免疫学[M].北京：人民军医出版社,1995：351.

　　[5]汤勇.昆明山海棠的免疫抑制机理研究进展[J].云南医药，2005，26(3)：289.

　　[6]韩玉.昆明山海棠药理作用研究进展[J].国外医学：中医中药分册，2005，27(5)：272.

　　[7]Couriel D，Caldera H，Champlin R，et al.Acute graftversushost disease：pathophysiology，clinical manifestations，and management[J].Cancer，2004，101(9)：1936.

　　[8]林科雄，王长征，钱桂生.雷公藤甲素对诱导CD+4、CD+8T细胞凋亡的作用[J].免疫学杂志，2000，16(1)：24.