临床产ESBLs细菌流行病学及耐药特性研究

摘　要　目的：研究产超广谱ß—内酰胺酶(ESBLs)细菌流行情况及其对常用24种抗菌药敏感性。方法：先后用头孢硝噻吩及纸片扩散初筛法、纸片扩散确认法从临床分离的肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌共289株中检测出39株产ESBLs菌株，用微量稀释法测定24种不同类抗生素对上述39株细菌的MIC值，用超声破碎法及可见—紫外分光光度计分析比较ß—内酰胺酶抑制剂舒巴坦、克拉维酸及他唑巴坦对ESBLs的抑制作用。结果：我院临床分离肺炎克雷伯菌产ESBL5率为16．7％、大肠埃希菌产ESBLs率为12，4％。产ESBLs细菌对青霉素类及三代头孢菌素类耐药率均较高，它们对氨苄西林、阿莫西林、头孢哌酮、替卡西林、哌拉西林及美洛西林的耐药率分别为：大肠埃希菌，100％，100％，100％，100％，96，3％和81．5％；肺炎克雷伯菌，100％，100％，91．67％，91．6了％，83．33％和75％．加用酶抑制剂后能显著降低上述抗生素的耐药率，它们对阿莫西林十克拉维酸、替卡西林十克拉维酸，氨苄西林十舒巴坦、头孢哌酮十舒巴坦、哌拉西林十他唑巴坦和美洛西林十舒巴坦的耐药率为：大肠埃希菌，89.89％，55.5％，48.1％，3.7％，0％和0％；肺炎克雷伯菌，58.35％，16.67％，50．02％，0％，8．37％，和8．33％．这些细菌同样表现出对磺胺类、喹诺酮类及第四代头孢菌素有较高的耐药率，它们对复方磺胺、环丙沙星及头孢吡肟的耐药率分别为：肺炎克雷伯菌，77．8％，74．1％和18．6％；大肠埃希菌，50％，16.67％和25％。但它们对阿米卡星的耐药率为：肺炎克雷伯菌7．4％和大肠埃希菌25％，与第四代头抱菌素类似有较低的耐药率；而非典型ß—内酰胺类抗生素头孢西丁、头孢美唑及拉氧头孢对产ESBLs菌株表现出相当高的敏感率，大肠埃希氏菌分别为，100％，100％和100％；肺炎克雷伯菌分别为，83．43％，75％和91．67％．对于所有的受试菌株碳青霉烯类的伊米培能和美罗培南表现了最高的敏感率未发现耐药菌株。ESBLs对单独头孢哌酮的水解率为43．93％，而当结合了舒巴坦时对头孢哌酮的水解率下降为20．91％，而当结合了克拉维酸时为18．13％；而当结合了他唑巴坦时为15．27％。结论：产ESBLs细菌对青霉素、头孢菌素类耐药率较高，并对不同类抗菌素有多重耐药的特点。它们对头霉素类及氧头孢烯类表现出相当高的敏感率；碳青霉烯类仍然是对产ESBLs细菌最有效的药物。酶抑制剂对产ESBLs细菌的体外效果以头孢哌酮为共同底物的情况下为他唑巴坦略优于克拉维酸，但二药都强于舒巴坦。
关键词　超广谱ß—内酰胺酶(ESBLs)　耐药性

　　细菌产ß—内酰胺酶是其耐药的主要机制，而由质粒介导的超广谱ß—内酰胺酶(ESBLs)是对新一代ß—内酰胺类抗生素耐药的主要原因。ESBs由质粒介导，易在同种属甚至不同种属细菌间传递造成暴发流行，国外已有多起暴发流行的报道[1、2]ESBLs的出现给临床抗感染治疗带来众多问题：死亡率增高、住院时间延长、治疗经费上升、医生的治疗选择越来越少等等。ESBLs在国内外已引起广泛重视，但由于ESBLs检测困难及费用较高，一些检测方法尚无法在临床统一推广，对ESBLs分布及流行的专门研究尚很少。随着新型抗生素的临床应用增多，更加需要对这些抗生素与ESBLs之间的关系进行研究．本实验以我院临床分离的菌株为对象，采用NCCCLS承认的方法检测产ESBLs细菌的情况从而了解产ESBLs细菌的流行分布，在此基础上进一步探讨各类抗生素、酶抑制剂等和产ESBLs细菌的相互作用关系，以期对临床预防、治疗产ESBLs细菌及合理应用抗生素提出指导。材料和方法

1　材料
1．1　菌　株
　　我院1999年3月至11月间住院病人临床分离的来自血液、尿液、痰、胆汁、咽拭子、穿刺液、分泌液、脓汁及伤口引流液的289株细菌，其中包括肺炎克雷伯杆菌(217株)，大肠埃希菌(72株)，全部经常规方法和法国生物梅里埃公司Vitek—30型机器鉴定。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922；绿脓杆菌ATCC 27853；标准产TEM4、SHV3、SHV5大肠埃希菌(美国IoWA大学抗感染研究中心)。

1．2　试剂及试纸
　　药敏纸片(北京天坛药物生物技术开发公司)：奥格门汀(阿莫西林30μg／克拉维酸10μg／片)，头孢他啶(30μg／片)，头孢三嗪(30μg／片)，头孢噻肟(30μg／片)，氨曲南(30μg／片)。药敏纸片(天津金章医用新技术研究所)：头孢他啶(30μg／m1)头孢他啶(30μg／m1)十克拉维酸(10μg／m1)；头孢噻肟(30μg／m1)／头孢噻肟(30μg／m1)十克拉维酸(10μg／m1)。Nitrocefin试剂(英国Oxid公司)，Mueller—Hinton琼脂(英国OKid公司)，Mueller—Hinton肉汤(英国Oxid公司)。96孔药敏板(天津金章医用新技术研究所)含8个倍比稀释度的如下药物：氨卞青霉素、优立新、阿莫西林、奥格门汀、替卡西林、特美汀、头孢哌酮、舒普森、美洛西林、美洛巴坦、哌拉西林、他唑西林、伊米培能、美洛培南、拉氧头孢、头孢美唑、头孢西丁、头孢吡肟、头孢地嗪、环丙沙星、左旋氧氟沙星、丁胺卡那霉素、复方磺胺、头孢他啶。抗生素及酶抑制剂：头孢哌酮及舒巴坦(大连辉瑞公司赠送)、克拉维酸(史克美占公司赠送)、他唑巴坦(海南三洋德林公司赠送)。0．05MPH7．0磷酸钾缓冲液(PB)。

1.3　仪　器
　　可见—紫外分光光度计(日本岛津制作所MPS—2000型外接岛津超级恒温水浴槽)，HZS—H型恒温水浴震荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，JY88—H型超声波细胞粉碎机(宁波市新芝科学仪器研究所)，Biofuge22R型高速低温离心机(德国11ERAEUS公司)，ECß一3000型电泳仪(北京六一仪器厂)，DYY一皿230型电泳槽(北京六一仪器厂)ZF　型紫外分析仪(上海康化生化仪器厂)，法国生物梅里埃公司Vitek比浊仪。

2　方法
2.1　产ESBLs细菌的初筛及确认：受试菌株经头孢硝噻吩确认为产ß—内酰胺酶后，均按　1999年1月NCCLS推荐的标准纸片扩散法进行初筛及确认。同时用头孢他啶、头孢三嗪、头孢噻肟、氨曲南纸片检测并测量各药物抑菌圈直径，如头孢他啶＜22mm、头孢三嗪＜25mm、头孢噻肟＜27mm、氨曲南＜27mm这中间符合一项以上即可符合产ESBIj细菌初筛条件应进一步行纸片扩散确认法实验。受试菌同时用头孢他啶、头孢他啶加克拉维酸的纸片和头孢噻肟、头孢噻肟加克拉维酸的纸片进行检测，分别测量头孢他啶、头孢噻肟和头孢他啶加克拉维酸、头孢噻肟加克拉维酸的抑菌环直径，其中任意一种抗生素加克拉维酸的抑菌环直径大于不加克拉维酸的抑菌环直径5mm或5mm以上即可确认该试验菌株为产ESBLs菌株。

2.2　抗生素对产ESBLs细菌的MIC测定：采用微量稀释法测定。

2.3　酶抑制剂对产ESBLs细菌的抑制作用实验：用超声破碎法提取各菌株的ß—内酰胺酶后，以头孢哌酮为共同底物用可见—紫外分光光度计测定并计算舒巴坦、克拉维酸、他唑巴坦对ß—内酰胺酶水解头孢哌酮的保护作用。

结　果

1　产ESBLs细菌的初筛及确认　289株受试菌经头抱硝唆吩实验检出267株产ß—内酰胺　酶菌株。经纸片扩散法初筛出51株可疑产ESBLs菌株，经纸片扩散确认法确认出39株产　ESBLs菌株(肺炎克雷伯菌12株、大肠埃希氏菌27株)。故我院1999年3月至11月间临床分离肺炎克雷伯菌产ESBL3率为16．7％、大肠埃希氏菌产EsBLs率为12．4％。从该结果看产BSBLs细菌在临床的分离率已达到不容忽视的程度，有必要对其耐药特性进行进一步的研究。

2　抗生素对产ESBLs细菌的MIC测定　从表1和表2的结果可以发现，产ESBIj细菌青霉素类及三代头孢菌素类耐药率均较高。对青霉素类及三代头孢菌素类耐药率约为70—100％，青霉素类及三代头孢菌素类和酶抑制剂的合剂对产ESBLs细菌的效果均较未加酶抑制剂的效果好，各抗生素与其酶抑制剂合剂之间比较它们之间的耐药率ß值均小于0．05差异有统计学意义，这和文献报道的结果一致。其中舒谱深和他唑西林表现出较高的敏感率，达到50％以上，而耐药率仅为2．56％。产ESBLs细菌对磺胺类、喳诺酮类耐药率分别达到约69．23％及45％左右，要高于抗生素与抗生素酶抑制剂合剂。产EsBLs细菌对头孢砒肟的耐药率为23．08％，敏感率为41．03％，虽然第四代头抱菌素对ß—内酰胺酶稳定性高，但对于产ESBLs细菌所致感染的疗效要差于对染色体介导的ß—内酰胺酶如Amßc酶的疗效。；传统对产ESBLs细菌敏感的碳青霉烯类、头霉素类及氧头霉素类仍保持较高的抑菌及杀菌效果，其中头孢西丁的敏感率为94．88％，头孢美唑的敏感率为92，32％，拉氧头孢的敏感率为97，44％。效果最好的伊米培能、美罗陪南敏感率均为100％。

3　酶抑制剂对产ESBLs细菌的抑制作用实验　抗生素水解实验表明ESBLs对头孢哌酮的平均水解率为43．9％，应用酶抑制剂后头孢哌酮平均水解率舒巴坦组下降至25，6％，克拉维酸组下降至19．5％，他唑巴坦组下降至15．9％。用T检验统计表明：所有酶抑制剂组和单纯头孢哌酮组之间P值均小于0.01差异有统计学意义，各酶抑制剂组之间舒巴坦组与他唑巴坦组之间P值小于0．05差异有统计学意义，而舒巴坦与克拉维酸、克拉维酸与他唑巴坦组之间P值大于0．05差异无统计学意义。结合水解率均数比较，对产ESBIJs细菌酶抑制剂的效果应为他唑巴坦略强于克拉维酸，但二药都强于舒巴坦。

表1　12种抗生素对产ESBLs细菌体抗菌外活性
抗　生　素
敏　感　率　(％)
中　介　率　(％)
耐　药　率　(％)

复方磺胺
30．77
0
69．23

环丙沙星
41．03
2．56
56．41

可乐必妥
43．59
10．26
46．15

阿米卡星
84．62
2．56
12，82

头孢地嗪
0
2．56
97．43

头孢他啶
67，67
7．73
25．6

头孢吡肟
41．03
38．46
20．51

头孢美唑
92．32
2．56
5．13

头孢西丁
94．88
2．56
2．56

拉氧头孢
97．44
0
2．56

伊米培能
100
0
0

美罗培南
100
0
0

表2　6种抗生素及其与内酰胺酶抑制剂复合制剂对产ESBLs细菌体抗菌外活性

抗　生　素
敏　感　率　(％)
中　介　率　(％)
耐　药　率　(％)

氨苄西林
0
0
100

哌拉西林
0
7．69
92．3l

头孢哌酮
0
2．56
97．43

阿莫西林
0
0
100

替卡西林
0
2，56
97，43

美洛西林
0
20．5
79．5

优立新
15．36
35．84
48．8

他唑西林
53．76
43．68
2．56

舒谱深
56．32
41．12
2．56

奥格门汀
2．56
33．28
64．16

特美汀
2．56
53．76
43．68

美洛巴坦
17．92
79．52
2．56

讨　论

　　我们的研究结果表明临床产ESBLs细菌的分离率已经达到了相当高的比率，该结果和本地区其他医院的相似，但却要低于广州和上海的分离率。这种分离率的差异可能和不同医院、地区使用第三代头孢菌素的种类、数量及时间不同而造成对ESBLs的筛选及诱导不同有关。

　　从对确认产ESBLs细菌的耐药特点来看，产ESBLs细菌对青霉素、头孢类的耐药率均较高，临床治疗应避免使用上述抗生素。酶抑制剂能够显著提高ß—内酰胺类抗生素对产ESBLs细菌的敏感率，酶抑制剂对产ESBLs细菌的抑制作用实验亦表明了这一结论。本实验以头孢哌酮为共同底物的条件下，他唑巴坦和克拉维酸表现出较强的对产ESBLs细菌的抑制作用，所以ß—内酰胺类抗生素和酶抑制剂合剂是治疗产ESBIJs细菌的有效药物。但值得注意的是本实验中仍有部分ß—内酰胺类抗生素和酶抑制剂合剂对产ESBLs细菌的敏感率较低，比如约47．5％左右的菌株对舒谱深和他唑西林表现出中敏，这种情况在各抗生素与抗生素酶抑制剂合剂之中比较普遍。其原因可能为长期应用酶抑制剂治疗使得细菌对酶抑制剂敏感性下降，或者细菌为高产酶株或产生两种ß—内酰胺酶所致。产ESBLs细菌同样表现出对不同类抗生素的多重耐药特点，产ESBLs细菌对不同类抗生素的耐药主要在于该类细菌同时携带了耐多类药物的基因。而阿米卡星的敏感率达到了84．5％，耐药率为15．38％，这可能是因为对阿米卡星的耐药主要是由于细胞壁的屏障作用引起，而不象其他氨基糖甙类抗生素主要由耐药质粒携带了各类钝化酶的基因所致。对产ESBLs细菌仍保持较高敏感率的头霉素、氧头孢烯类及碳青霉烯类仍是我们对付产ESBLs细菌的最有效的药物。