双重 PCR快速检测海螺中单增李斯特菌

双重 PCR快速检测海螺中单增李斯特菌 ;

王昊宇

大庆医学高等专科学校，黑龙江 大庆 163312

摘要：探讨检测新鲜海螺样品中单增李斯特菌的双重PCR快速检测方法。为检验方法可行性，对市场随机抽取的126份新鲜海螺样品进行检测，选择增菌后3h内快速检出PCR阳性样品26份，应用国家标准方法（GB/4789.30-2010）对PCR阳性结果进行验证，验证结果表明：PCR阴性样品中未有单增李斯特菌检出；同时出现两特异条带的 PCR阳性样品均有单增李斯特菌检出，只出现单一条带的PCR阳性样品中有1份未检出单增李斯特菌，该双重PCR检测方法的假阳性率为0.99%。

关键词：单增李斯特菌；双重PCR；海螺样品

随着分子生物学技术的快速发展，多重PCR方法因其快速、特异、简便且准确度高的特点越来越多的应用于单增李斯特菌的检测中^[1]，然而该研究领域中以海产品为对象检测单增李斯特菌的相关报道较少，尤其是应用多重PCR技术检测特定某类海产品的实际应用并不多见，本研究将以此为切入点，将单增李斯特菌最重要的毒力因子-编码溶血素的hlyA基因，与李斯特菌属16sRNA基因同时作为单增李斯特菌的检测指标，将双重PCR方法与选择性增菌法相结合，应用于新鲜海螺样品的实际检测，得到的PCR阳性结果经国标方法（GB/4789.30-2010）验证，根据实际检测结果对该双重PCR检测方法进行评价。

1 材料与方法

1.1 引物序列

根据文献^[2]以单增李斯特菌hlyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因作为靶基因分别合成两对特异性引物。

1.2 海螺样品采集

6-7月份分为十个批次取样，共126份海螺样品，采样后把每份样品单独包装装入无菌塑封袋中，4℃冰盒取样4h内送到实验室检验。

1.3 生理生化鉴定

将1-126号海螺样品增菌液分别划线于李斯特菌显色培养基，35℃培养24h，将蓝绿色带有白色晕圈的可疑菌落挑出，划线TSA-YE上反复纯化，最终挑取灰白色、半透明、边缘整齐的单菌落，进行生理生化鉴定实验。

2 结果与分析

2.1 双重PCR快速检测新鲜海螺样品

将1-126号海螺样品增菌液DNA模板进行双重PCR扩增，图一（A、B、C）显示阳性结果：可见共有26份PCR阳性样品，其中出现两特异条带的阳性样品12份，出现单一条带的阳性样品14份。

702bp

M：DL2000；1：标准株阳性对照；2：8号；3：13号；

4：26号；5：32号；6：33号；7：46号；

8：55号；9：58号；10：63号

A

1000bp

M：DL2000；1：标准株阳性对照；2：68号；3：70号；

4：73号；5：74号；6：76号；7：82号；

8：83号；9：93号；10：97号

B

938bp

702bp

M：DL2000；1：标准株阳性对照；2：102号；4：103号；

5：105号；6：107号；7：112号；

8：115号；9：119号；10：125号 C

图一 双重PCR检测阳性结果

2.2 验证结果与

对126份样品中可疑单菌落进行生理生化实验，结果可知：12份同时出现两特异条带的PCR阳性样品中均可筛选到生理生化指标与单增李斯特菌标准株相同的阳性菌株，与常规实验结果符合率100%；14份只出现702bp条带的单一PCR阳性样品中有1份未检出单增李斯特菌，为73号样品；而没有条带出现的样品中未有单增李斯特菌检出。原因可能为：不同来源单增李斯特菌该目的因子发生变异或丢失；增菌液中的杂菌及海螺样品中含有的复杂成分对双重PCR反应有干扰。

参考文献：

[1]葛菲菲,徐锋,邱亚峰,等.用四重PCR检测方法检测产单核细胞李斯特菌[J].动物医学进展,2010,31(12):28-31.(J)

[2]王海艳,刘中学,等.食品中单增李斯特菌PCR检测方法所用引物的特异性比较[J].检验检疫科学,2007(6):3-8.(J)