食管组织和外周血中RNA提取方法研究

食管组织和外周血中RNA提取方法研究

皇甫月海

淮安市疾病预防控制中心江苏淮安223001

1.引言

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国的病例主要以食管鳞状细胞癌为主[1]，而江苏省淮安市是全国食管癌高发区。食管癌的发病率和死亡率居高不下的主要原因是早期症状不明显，临床就诊的患者多已处于中晚期，治疗效果相当有限，预后较差，因此遏制食管癌的流行主要依靠早期发现疾病。已有研究证实食管癌是遗传和环境共作用的疾病，和其他肿瘤类似，是多因素、多基因、多阶段发展的复杂疾病[2-3]。基于这些特点，对食管癌遗传特征的识别可为食管癌的早期诊断提供敏感特异的临床诊断指标。

本研究从食管组织和外周血中提取总RNA，探讨在不同种类样本间RNA提取方法，为筛选食管癌环境相关基因，揭示食管癌的遗传易感特征提供实验基础。

2.材料与方法

2.1样本收集

在取得患者知情同意书后，收集江苏省淮安市食管癌患者新鲜术后食管癌组织和食管癌旁正常组织，患者均未经过放化疗，病理确诊为原发食管鳞状细胞癌。采集术前5mL枸橼酸钠抗凝外周全血。

2.2试剂及仪器

所有耗材和器具均用DEPC处理8小时以去除RNA酶，Trizol（Invitrogen，LifeTech），RNALocker（天泽基因），人淋巴细胞分离液，DNA/RNA浓度测定仪（ND1000），ChemilmagerTM5500凝胶成像分析仪（AlphaInnotech）

2.3方法

2.3.1食管组织前处理

采集的食管癌组织和癌旁组织立刻放入3倍体积的RNALocker中，4℃过夜，弃保存液后-20℃保存。

2.3.2外周血前处理

取抗凝血2mL，与PBS1：1混匀后，小心加于4mL的人淋巴细胞分离液液面上，3000rpm，15min，离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的白膜，即：单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）层。

小心吸取白膜层到另一离心管中。用PBS稀1：1稀释，颠倒混匀，1500rpm，10min，弃上清，重复1-2次。

2.3.3总RNA提取

处理好的组织样本和分离的外周血单个核细胞中加入1mLTrizol，吹打混匀后。加入200ml氯仿，振荡lmin后室温放置15-20min。将离心管用低温离心机在4℃、12000rpm条件下离心15min。离心后样本分3层，小心将上层水样溶液转入另一1.5ml离心管。往其中按每lm1Trizol。等体积加入异丙醇，混匀后室温放置10-15min。再次将离心管用低温离心机在4℃、12000rpm条件下离心15min。弃上清，用75%的乙醇洗涤RNA沉淀。将离心管置入低温离心机在4℃、10000rpm条件下离心5min。弃上清，将RNA于室温、空气下干燥至半透明后加入无RNA酶水溶解。用紫外分光光度计测定RNA浓度，-80℃保存待用。

2.3.4RNA纯度和完整性检测

1）RNA纯度及含量鉴定：取3-5ulRNA测定A260/A280比值应为1.8-2.0，OD值为1相当于大约40ug/mlRNA；

2）RNA完整性鉴定：取1-2ulRNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，两条主要的电泳条带为28S（4.5kb）：18S（2.1kb）=2：1说明RNA完整无降解。

3.结果

3.1总RNA提取纯度

自食管组织和外周提取总RNA，行1%琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，可见清晰的28S和18S条带，5S带位于最前，较模糊。1，2为食管组织，3，4为外周血。

3.2总RNA的纯度

自食管组织和外周提取总RNA经ND-1000紫外分光光度测定浓度，OD260/280，OD260/230如表1。

4.讨论

我们应用Trizol抽提法对食管组织和外周血中的总RNA进行了提取和测定，发现经过RNALocker处理后的食管组织和人淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞均能很好的保持RNA的纯度和完整性。通过本次实验，建立了现场从采样到样本处理的模型，为食管癌环境相关遗传基因的检测奠定技术基础。

现有研究对组织的总RNA提取方法基本一致，而对外周血中的RNA提取方法各不相同。目前常用的RNA提取方法有酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法、oligo-纤维素层析法[4]等主要面临的困难有外周血容易受广泛存在的RNA酶降解，外周血中总RNA丰度较低，提取难度大等。本法首先分离出单个核细胞，再从成分单一的单个核细胞中提取RNA，克服了外周血提取RNA中易受蛋白质，多糖等物质的污染的缺点，且操作步骤简单，适用于现场采样，获取RNA的风度较高，结果的重复性好，适合下游PCR扩增等后续实验，值得推广。

参考文献：

[1]ChenJian-guo，LuJian-hua.PreventionandcontrolofcancerinChinaandtheworld[J].Tumor，2007，27（9）：755-759（InChinese）

[2]LinDong-xin，TanWen，LuShi-xin，etal.MolecularepidemiologyofesophagealcancerinChina[J].ChineseJournalofEpidemiology，2003，24（10）：939-943（InChinese）

[3]HiyamaT，YoshiharaM，TanakaS，etal.Geneticpolymorphismsandesophagealcancerrisk[J].IntJCancer，2007，121（8）：1643-1658

[4]萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯J1金冬雁，黎孟枫，译，分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1998.3432388.

作者简介：皇甫月海（1962-），男，中专，主管技师，主要从事理化检验工作