姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞的抑制作用

姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞的抑制作用

王厚清1王理军1刘修恒

（1监利县第二人民医院泌尿外科433325；2武汉大学人民医院泌尿外科430060）

摘要：目的探讨姜黄素（curcumin）联合硼替佐米（bortezomib）对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法CCK-8法测定姜黄素、硼替佐米及姜黄素联合硼替佐米作用于PC-3细胞后的细胞生存率，流式细胞技术测定细胞周期及凋亡率，免疫印迹检测凋亡蛋白caspase3表达水平。结果与对照组比较，姜黄素联合硼替佐米组能显著抑制PC-3细胞增殖（P<0.05），呈时间依赖性，阻滞PC-3细胞于G2/M期比例明显增多（P<0.05）。联合应用姜黄素和硼替佐米处理的PC-3细胞凋亡率较对照组高（P<0.05），凋亡蛋白caspase-3表达水平也较对照组增强。结论姜黄素联合硼替佐米可明显增强对PC-3细胞增殖的抑制和诱导凋亡作用，凋亡作用可能与其上调caspase3表达有关。

关键词：前列腺癌；姜黄素；硼替佐米；细胞凋亡

前列腺癌是一种发生于老年男性的常见肿瘤，大多数患者就诊时已属晚期，失去手术根治机会，内分泌治疗虽有效，但约2-3年后会出现去势抵抗，伴随化疗方案的改进，治疗效果虽有所提高，但患者的预后仍然较差。硼替佐米是一种新型蛋白酶体抑制剂，主要用于治疗多发性骨髓瘤[1]，但近年来发现其对前列腺癌等实体瘤也有一定的疗效[2]。姜黄素是从中药姜黄中提取的活性成分，具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、抑制血管生成及特有的抗肿瘤活性[3]。因此，我们尝试探索姜黄素协同硼替佐米对前列腺癌细胞的作用，以获取更好的抗癌效果。

1材料与方法

1.1材料

人前列腺癌细胞PC3购自中国科学院细胞典藏中心。硼替佐米购自西安杨森制药公司，姜黄素、CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，AnnexinV凋亡试剂盒购自联科生物科技有限公司，胎牛血清、RPMI1640培养液购自杭州四季青公司，兔抗人Caspase-3多抗购自Santacruze公司，羊抗兔IgG二抗购自博士德公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人前列腺癌细胞PC3在10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2CCK-8法测定PC-3细胞增殖活性

取对数期生长的PC3细胞2×104/孔接种于96孔圆底培养板，每孔添加100μl培养基，培养18h后分别加入硼替佐米（1.6μmol/L）、姜黄素（50μml/L）及硼替佐米（1.6μmol/L）+姜黄素（50μml/L）继续培养，每组设3个复孔，并设阴性对照组（不加化疗药物）。在培养24、48、72h各时间点，分别加入10ul/孔CCk-8溶液，再经2h培养后，酶标仪于450nm处测其吸光度（A）值。

1.2.3流式细胞仪检测PC-3细胞周期及凋亡率

取对数期生长的PC-3细胞5×104/孔接种于12孔圆底培养板，每孔添加2ml培养基，培养18h后，分别加入硼替佐米、姜黄素、硼替佐米+姜黄素，浓度同前。培养24h后收集细胞，PBS冲洗后用结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞数至1×106，取100μl细胞悬液加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI混匀后避光15min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集的细胞经PBS液洗涤2次后，加入预冷的70%乙醇固定细胞4℃过夜，用0.15ml的PI综合染液（含50g/LRNA酶）避光染色30min后，采用流式细胞仪检测。

1.2.4Westernblot检测

细胞给药处理后24h，提取细胞总蛋白，取40μg蛋白进行10％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转移蛋白至NC膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗3次；室温分别加入1：2000兔多克隆抗Caspase-3孵育2h，TBST洗膜3次，加入1：1000稀释的辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG，室温孵育2h，TBST洗膜3次，ECL法显色。

1.2.5统计学处理

采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析，数据以±s表示

2结果

2.1姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞增殖活性的影响

通过CCK-8比色法检测姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞PC-3的抑制作用，可见姜黄素与硼替佐米一样，作用后24、48、72h，对PC-3细胞有一定杀伤作用，即细胞生存率明显减低（P<0.05），而联合用药较单独用药的抑制作用更明显（P<0.05），且姜黄素联合硼替佐米的作用呈时间效应关系，72h较48h、48h较24h的抑制作用更大（P<0.05）。

2.2姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞周期的影响

流式细胞仪结果显示，姜黄素联合硼替佐米作用组处于G2/M期细胞比例明显增多（P<0.05），而处于G0/G1期细胞比例无明显（P>0.05），表明存在G2/M期阻滞。

2.3姜黄素联合硼替佐米对PC-3细胞凋亡的影响

姜黄素联合硼替佐米对前列腺癌细胞PC-3作用24h后通过FCM检测，联合用药较导致细胞凋亡率达（29.98±1.04）%，硼替佐米组（20.69±1.01）%、姜黄素组（21.65±1.03）%及对照组（4.67±0.18）%明显，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4caspase-3表达检测

Westernblot检测各组PC-3细胞中的caspase-3的表达量，结果可见在姜黄素、硼替佐米分别作用下，PC-3细胞表达caspase-3量较对照组升高，而联合用药较单独用药引起的caspase-3表达增加更明显。

3讨论

本研究中，当联合姜黄素与硼替佐米处理PC-3细胞时，PC-3细胞的生长抑制率和凋亡诱导率较单独用药更明显，结果表明联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用加强。本研究说明姜黄素可以增加硼替佐米对前列腺癌细胞的敏感性，同时增强硼替佐米诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在姜黄素的协同做用下，硼替佐米的抑制肿瘤作用明显增强，为探讨其机制，我们检测了caspase-3的表达水平。Caspase家族是细胞凋亡发生和调控机制中的重要因素，而caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者。基因敲除实验和动物模型也显示，抑制caspase-3活性将显著阻滞体外和体内的细胞凋亡。研究中发现给药组与对照组相比，各给药组caspase-3表达上调，联合给药组表达量上调更明显，说明PC-3细胞的凋亡抑制可能是caspase-3上调所导致。综上所述，姜黄素联合硼替佐米能得到较好的前列腺癌治疗效果，为探讨前列腺癌新的药物治疗奠下实验基础。

参考文献

[1]OcioEM，MateosMV，MaisoP，etal.Newdrugsinmultipleyeloma：mechanismsofactionandphaseI/Ⅱclinicalfindings.LancetOncol2008；9：1157-1165

[2]RyanDP，O’NeiBH，SupkoJG.AphaseIstudyofbortezomibplusirinotecaninpatientswithadvancedsolidtumors.Cancer2006；107：2688-2697

[3]HasimaN，AggarwalBB.Cancer-linkedtargetsmodulatedbycurcumin.IntJBiochemMolBiol.2012；3（4）：328-51