股骨头缺血性坏死与VEGFBMPTGF表达的相关性研究

股骨头缺血性坏死与VEGFBMPTGF表达的相关性研究

黎列华1鲁厚根2

长江大学第二临床医学院荆州市中心医院

摘要：目的结合MRI、DR等临床影像学资料，首先对股骨头缺血性坏死进行诊断和分级，然后分析相关细胞因子在股骨头缺血性坏死患者外周血清和髋关节液中的表达及其临床意义。方法实验组荆州市中心医院进行就诊的诊断为股骨头缺血性坏死的患者58例，然后根据Ficat临床分期分为早中晚期，并检测TGF-β、BMP和VEGF的含量；对照组选取荆州市中心医院门诊体检中心的健康体检自愿者58例的外周血清和髋关节液标本，检测血清和髋关节液中的TGF-β、BMP和VEGF的含量。结论相关细胞因子参与了股骨头缺血性坏死的形成和发展，在股骨头缺血性坏死反应过程中，TGF-β、BMP、VEGF可作为评估股骨缺血性坏死严重程度的有效指标。

股骨头缺血性坏死(ANFH)作为全世界范围内的一种常见病与多发病，它以髋关节为好发部位，该病经常导致髋关节疼痛与功能障碍,甚至出现忧郁和焦虑的精神问题；这些病症严重降低了患者的生活质量[1]。本次研究拟通过分析股骨头缺血性坏死（ANFH）患者的血清及关节液中相关细胞因子的浓度的变化，为股骨头缺血坏死患者病情变化的严重程度提供生化指标参考，进而对股骨头缺血性进行早期诊断，早期干预和治疗，提高患者的生活质量。

1材料与方法

1.1研究对象选取2016.9-2017.9在荆州市中心医院骨科就诊的股骨头缺血性坏死的患者，实验对象的纳入标准：①根据患者症状体征及X线作为主要诊断及分期标准；②所有研究对象均无服用激素类、免疫抑制剂等药物病史；③实验对象愿意接受髋关节穿刺术，进行常规术前沟通谈话，同意在穿刺术中对其髋关节液进行搜集，并且签署特殊检查知情同意书；实验对象的排除标准：①合并一些内科的慢性疾病患者，例如心脏病，肾病，肺结核，糖尿病，风湿性类风湿性关节炎，骨性关节炎，痛风病等以及一些严重肝肾功能的相关疾病；②先天性髋关节发育不全或畸形者，髋关节结核患者③髋关节及股骨头近期有过外伤历史，或为骨质疏松骨折患者。所有研究对象均行相关生化检查，如血液分析，门诊或住院肝肾功能检查、血电解质、空腹血糖，凝血功能分析，输血全套，风湿全套等。实验组试验对象共有58例，其中男性患者31例，女性患者27例，年龄32-65岁，平均年龄为（44.6±10.2）岁,平均体重指数为（24.1±0.8）Kg/m2；对照组来源于同期间在荆州市中心医院体检健康的自愿者58例，男性患者32例，女性患者26例，年龄30-62岁，平均年龄（45.1±9.1）岁，平均体重指数(25.0±0.9)Kg/m2。

1.2股骨头缺血性坏死的X线分级及临床分期标准

ANFH的轻中重度分级按Ficat分级[2-5]进行处理：①轻度患者主要包括Ficat分期中的0期和I期，X线表现为正常，或有轻度弥漫性骨质疏松改变，且患者有疼痛和髋关节活动受限症状，伴有或不伴有骨的功能检查阳性结果;②中度患者主要包括Ficat分期的II期、III期和过渡期，II期在X线上有骨重建的迹象但股骨头外形及关节间隙仍无改变，表现为坏死区骨质疏松、骨硬化和囊性变，髓芯活检肯定有组织病理学改变，临床症状明显；过渡期介于Ⅱ期和Ⅲ期之间，表现为软骨下骨折具体表现为新月征，或者存在股骨头局灶性变扁;Ⅲ期:X线片显示股骨头内硬化、囊性变，股骨头塌陷，有新月征，关节间隙正常，临床症状加重；③重度患者主要指Ficat分期的IV期，主要表现为进行性的髋关节软骨丢失和髋臼骨赘形成等类似于骨性关节炎的病变特征，且存在髋关节疼痛明显、各项活动受限。根据诊断标准及分期标准，分级如下，早期ANFH患者26例，中期患者18例，晚期患者14例。

1.3实验试剂和实验仪器

①人类TGF-β1试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）

②人类BMP-2ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）

③人类VGEFELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）

④BCV-206新飞牌冷藏冷冻箱（河南新飞电器有限公司）

⑤普通冰箱（中国美的公司）

⑥震荡仪（广州IKL公司）

⑦PBS缓冲液（荆州中心医院病理科）

⑧离心管（荆州中心医院病理科）

⑨EP管（荆州中心医院病理科）

1.4标本的收集和处理

所有研究的实验对象包括实验组和对照组需要空腹完善相关生化检查，同时取患者右肘静脉外周血液20ml，并且抽取髋关节液；髋关节液的采集需在相关规定操作和严格的无菌条件下进行：体检中心患者取仰卧位以2%利多卡因5ml局部麻醉后，于大转子前下方，穿刺针与大腿表面呈45°角刺入髋关节囊，刺入关节腔后抽取髋关节液1-3ml，住院病人照前面所述穿刺方法抽取髋关节液1-3ml。标本取出后进行2000r/min的高速离心，上层清液移至多聚丙烯管（EP管）中，封口后存放于-80°冰箱中保存，等待进行ELISA检测。

1.5实验方法

采用ELISA法检测所有实验对象血清及髋关节液中TGF-β、BMP及VEGF的浓度，具体的实验步骤如下：

①从冰箱中取出所买的试剂盒，并且在20-26℃的室温中放置约30分钟；取出实验所需的板条，贴上标签分别注明实验组和对照组；

②建立实验所需标准曲线：于板条上设置8个标准孔，按次序依次加入100ul样品稀释液，于第一个标准孔中加入100ul标准品，充分混匀后用加样器吸取100ul液体移到第二个标准孔中，如此反复进行至第七孔，最后将第七标准孔中吸取的100ul液体丢弃，使所有标准孔中液体体积均为100ul。同时第八孔为对照孔。

④取材样品，再次冲洗板条3次，每次需浸泡约5分钟，然后在滤纸上吸干；每个标准孔中加入100ul酶标工作液；将反应板条放入37℃恒温箱中保持30分钟。

⑤冲洗板条5次，每次浸泡约2分钟，然后用滤纸吸干；每个标准孔加90ulTMB工作液；用锡箔封闭纸，放置于37℃恒温箱中避光反应约20分钟。

⑥每孔加1滴TMB终止液；与420nm处用酶标仪测量标本的吸光值。

2.数据统计学处理

本次实验所活动的实验数据均采用Excel软件进行整理后，使用统计学软件SPSS19.0对收集到的数据进行统计学处理,其中计量资料采用t检验，计数资料行卡方检验，外周血清和关节液中各项炎症相关细胞因子浓度指标用均数士表准差(±s)表示,用t检验进行组间显著性测试,P<0.05代表有统计学意义。

3.结果

3.1两组研究对象基本情况比较

实验组与对照组实验对象基本情况对比发现，两组研究对象中人数采用卡方检验，年龄及体重指数采用t检验进行比较，得出结论为在平均年龄、性别和体重指数几方面均无明显差异性，所以研究所得数据具有可比性(P>0.05)。见表1

表1两组研究对象的基本情况（±s）

3.2两组研究对象血清中TGF-βBMPVEGF浓度的变化

通过对实验组和对照组外周血清中TGF-βBMPVEGF浓度的分析发现：实验组血清中TGF-β、BMP及VEGF的浓度较对照组均有明显的增高（P＜0.05），所得数据采用t检验进行统计学分析。见表2

表2两组研究对象血清中TGF-βBMPVEGF浓度的变化(ng/L)

3.3两组对象关节液中TGF-βBMPVEGF浓度的变化

通过对实验组和对照组关节液中TGF-βBMPVEGF浓度的分析发现：实验组患者的关节液中TGF-βBMP及VEGF的浓度较对照组均有明显的增高（P＜0.05）。见表3

表3两组患者关节液中TGF-βBMPVEGF浓度的变化(ng/L)

3.4实验组内ANFH不同时期血清中TGF-βBMPVEGF浓度的变化

实验组组内患者血清中细胞因子浓度的变化说明在ANFH的演变过程中，TGF-β、VEGF的浓度的变化随病情加重而增高（P＜0.05），而BMP在发病早期增高明显，而中、晚期浓度增高不明显（P＞0.05）。见表4

表4实验组内ANFH不同时期血清中TGF-βBMPVEGF浓度的变化（ng/L)

3.5实验组内ANFH不同时期关节液中TGF-βBMPVEGF浓度的变化

实验组组内患者关节液中细胞因子浓度的变化说明在ANFH的演变过程中，TGF-β、VEGF的浓度的变化随病情加重而增高（P＜0.05），而BMP在发病早期增高明显，而中、晚期浓度增高不明显（P＞0.05）。见表5

表5实验组内ANFH不同时期关节液中TGF-βBMPVEGF浓度的变化（ng/L)

4讨论

国内外实验及研究已经证实，股骨头缺血性坏死的发生在很大程度上与髋关节内炎症反应及患髋股骨头的自我修复机制有有着密不可分的关系；而这些机制的进行都离不开机体细胞因子直接或者间接的调控；在这些与股骨头缺血性坏死的相关细胞因子中，TGF-β、BMP及VGEF在ONFH在股骨头缺血性坏死中起到主要作用。BMP作为一种最重要的骨诱导生长的细胞因子,它在发挥作用时不需蛋白水解进行激活,是唯一的能够诱导异位成骨的细胞因子；它主要是通过诱导骨髓中的多潜能干细胞向软骨细胞和骨细胞方向分化,并且抑制其向脂肪细胞和肌细胞的方向分化。所以在股骨头缺血性坏死的病程发生发展过程中，多种相关联的细胞因子组成一个庞大的连锁反应链条系统，在这些庞大的连锁反应中TGF-β、BMP及VGEF扮演着重要的作用；它们的相互作用启动早期的股骨头坏死的修复机制重要因素；随着股骨头缺血性坏死病情的发生与发展，各种细胞因子的浓度也在不断的变化当中。通过本次实验研究，来探讨血清及髋关节夜中各种细胞因子的浓度变化，以期为股骨头缺血性坏死早期诊断提供更多的科学依据，同时还可以结合相关影像学资料判断出股骨头缺血性坏死的严重程度，为股骨头坏死预后做出贡献。

参考文献

[1]MontMA，HungerfordDS．Non-traumaticavascularnecrosisofthefemoralhead［J］．JBoneJointSurgAm，1995，77(3):459－474．

[2]ArletJ，MazièresB．Naturaldevelopmentofnon-traumaticosteonecrosisofthehip［J］.ActaOrthopBelg，1999，65Suppl1:47－50．

[3]MontMA，MarulandaGA，JonesLC，etal．Systematicanaly-sisofclassificationsystemsforosteonecrosisofthefemoralhead［J］．JBoneJointSurgAm，2006，88Suppl3:16－26．

[4]刘日华,易诚青,等.应用血管内皮生长因子基因治疗股骨头缺血性坏死的实验研究[J].中国骨伤,2005,18(10):604-606.