盐酸曲美他嗪对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞分泌GSH-PX和ET-1的影响

盐酸曲美他嗪对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞分泌GSH-PX和ET-1的影响

吴敬敬燕建锋

吴敬敬燕建锋伊犁哈萨克自治州新华医院（新疆伊犁835000）

【摘要】目的探讨盐酸曲美他嗪对体外高糖诱导人脐静脉血管内皮细

胞分泌GSH-PX和ET-1的影响及其机制。方法将人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC分别培养在含5

.5mmol/L葡萄糖（A组）、30mmol/L葡萄糖(B组)、30mmol/L葡萄糖+1μmol/L盐酸曲美他嗪（C组）、30mmol/L

葡萄糖+10μmol/L盐酸曲美他嗪（D组）、30mmol/L葡萄糖+100μmol/L盐酸曲美他嗪（E组）的培养基中培养48小时，分别进行细胞培养上清液谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活力、内皮素-1（ET-1）分泌量的测定。结果B、C、D、E组的细胞活力、MDA含量、GSH-PX活力及ET-1的分泌量与A组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；C、D、E组的GSH-PX活力、ET-1的分泌量与B组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

结论盐酸曲美他嗪对体外高糖诱导损伤的内皮细胞具有保护作用，其作用机制可能通过保护细胞线粒体、清除活性氧、提高内皮细胞抗氧化酶体系的活力、抑制ET-l的分泌而实现对高糖损伤血管内皮细胞的保护效

应。

【关键词】高糖内皮细胞盐酸曲美他嗪抗氧化谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）内皮素-1（EU-1）

［中图分类号］R696［文献标识码］A［文章编号］1810－5734(2010)8-0006-02血管内皮细胞功能障碍不但是动脉粥样硬化致心血管疾病的主要原因，亦是糖尿病血管并发症的始动环节［１］。伴有糖尿病（DM）的冠心病患者比不伴有DM者具有更高的冠脉疾病的发病率,且预后差,死亡率高［２］。盐酸曲美他嗪是长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)抑制剂，一种新的代谢性药物,具有抗心肌缺血和改善内皮细胞功能的作用［３］。本实验采用体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvascularendothelialcells，HUVEC)损伤，建立HUVEC的高糖损伤模型，观察盐酸曲美他嗪是否对高糖损伤的HUVEC具有保护作用，并探讨其可能的机制。

1材料与方法

1.1主要材料及设备

盐酸曲美他嗪（施维雅公司惠赠）；人脐静脉血管内皮细胞（武汉大学培养物保存中心

)；

低糖型DMEM培养基（葡萄糖终浓度5.5mmol/L）（美国GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程研究所）；噻唑蓝（MTT，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，上海生工生物工程有限公司）；谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、人内皮素-1定量酶联检测试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；CO2恒温培养箱（Heraeus公司）；酶联免疫检测仪（芬兰雷勃公司）；752型紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和实验分组方法将冻存的HUEVC复苏后，用含10%小牛血清的低糖型DMEM培养基培养，同时加入100U/L链霉素（华北制药股分有限公司）和100U/L青霉素（华北制药股分有限公司），在37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞生长融合成单层，用0.25%的胰蛋白酶加等量0.2%的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（无锡医药采购站）消化收集细胞，均匀接种于24孔或96孔的培养板中。在每次实验中，待细胞融合前用无血清的低糖型DMEM培养基培养进行同步化处理，在换用条件培养基前，用台盼蓝染色，判断细胞活性，保证实验所用细胞中的活细胞数占细胞总数的97%以上，再换用含10%小牛血清的不同葡萄糖浓度的DMEM条件培养基培养细胞，每24h换液一次，培养48h后终止培养，遂进行相关指标的检测。盐酸曲美他嗪用DMSO助溶，用含血清培养液配置成终浓度为200μmol/L的贮存液，稀释成相应浓度用于实验（其中DMSO的终浓度不超过0.5%）。实验分组：A组为正常对照组（葡萄糖的终浓度为5.5mmol/L）；B组为高糖损伤组（结合研究［４］选用30mmol/L为高糖损伤浓度，葡萄糖的终浓度为30mmol/L）；C、D、E组分别为1μmol/L盐酸曲美他嗪+高糖组、10μmol/L盐酸曲美他嗪+高糖组、100μmol/L盐酸曲美他嗪+高糖组。

1.2.2细胞GSH-PX活力的测定方法：采用二硫对二硝基苯甲酸（DTNB）直接显色法，操作步骤按照GSH-PX测定试剂盒的说明进行。细胞以1×105/孔接种于24孔板，分组及处理方法同上。细胞终止培养后收集各组上清液100uL，于412nm波长测定其吸光值，计算各组GSH-PX活力值。

1.2.3ET-1分泌量的测定方法采用双抗夹心ELISA法，操作步骤按照ET-1试剂盒的说明进行。细胞以2×104/孔接种于24孔板，分组及处理方法同上。终止培养后收集各组上清液100uL，于492nm波长测定其吸光值，根据吸光值计算出各组ET-1的分泌量。

1.3统计学方法：所测资料均以（X[TX-]±s）的形式表示，各组样本均数的比较采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1盐酸曲美他嗪对高糖诱导HUVECGSH-PX活力值的影响

各组GSH-PX活力间差异有统计学意义（P＜0.01）。B组GSH-PX活力明显低于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）；C组、D组、E组的GSH-PX活力低于B组，随着盐酸曲美他嗪药物浓度的增高，GSH-PX活力逐渐增加，且呈剂量相关性，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.

05）。

2.2盐酸曲美他嗪对高糖诱导HUVECET-1分泌量的影响

各组ET-1分泌量间差异有统计学意义（P＜0.01）。B组ET-1分泌量明显高于A组间，差异有统计学意义（P＜0.01）；C组、D组、E组的ET-1分泌量较B组有所下降，且着盐酸曲美他嗪药物浓度的增高，TE-1分泌量逐渐下降，呈剂量相关性，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。

3讨论

有研究表明，合并有DM的冠心病和（或）高血压病患者较不伴有DM者具有更高的冠状动脉疾病的发病率、致残率和病死率，预后差，原因在于其存在着共同的病理生理基础—血管内皮功能损伤，目前有研究认为在DM发生之前就存在着一连串的心血管危险因素［６］，而将DM与血管性疾病相联系起来的就是内皮功能障碍机制［７］。

盐酸曲美他嗪是一种新的代谢性药物，是3-KAT抑制剂，直接刺激心肌或间接促进心肌葡萄糖代谢，可减少高能磷酸盐生成过程中对氧的需求，降低产生ATP时的氧耗，增加心肌缺氧时利用氧的效能。实验与临床研究显示：盐酸曲美他嗪除了具有保护心肌细胞改善心功能的作用外，还具有改善内皮细胞功能的作用［８］。

丙二醛（MDA）是机体产生氧自由基、引发脂质过氧化而形成的脂质过氧化物，可间接反映细胞损伤程度，而超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-PX的活力反应机体清除氧自由基的能力。本研究结果显示，高糖刺激HUVEC48h后，细胞上清液中GSH-PX活力下降，与正常对照组间差异有统计学意义，表明高糖条件下能增强内皮细胞的脂质过氧化，加重内皮细胞的损伤，而高糖损伤的HUVEC经盐酸曲美他嗪干预后，C、D、E组细胞GSH-PX活力明显改善，与B组间差异有统计学意义，说明盐酸曲美他嗪可改善高糖损伤的内皮细胞的功能，且呈现剂量依赖性，其机制可能是通过清除活性氧自由基、提高内皮细胞抗氧化酶体系的活力来实现的。

ET-1是由21个氨基酸所构成的一种强烈而持久的血管收缩肽，主要由血管内皮细胞合成，它的稳定表达对维持血管的基础张力至关重要，其水平的升高可使血管痉挛促使血栓形成并诱发动脉粥样硬化［１０］。本试验结果显示，高糖损伤组细胞上清液种ET-1的含量较正常对照组明显增加（P<0.01），而高糖损伤的HUVEC经盐酸曲美他嗪干预后，ET-1的分泌量明显下降，与高糖损伤组间差异有统计学意义，说明盐酸曲美他嗪可以抑制内皮细胞ET-1的分泌，且呈现剂量依赖性，减少了ET-1对血管内皮的损伤，进尔减少了心血管事件及糖尿病血管并发症的发生及发展。

本研究提示体外培养的HUVEC在高糖条件下可使脂质过氧化作用增强，GSH-PX活力下降，ET-1分泌增加，共同导致内皮功能障碍。同时盐酸曲美他嗪可拮抗高糖引起的血管内皮细胞损伤，其作用机制可能与清除活性氧、降低脂质过氧化、提高内皮细胞抗氧化酶体系的活力、抑制内皮细胞ET-1的分泌等有关，在冠心病及糖尿病的治疗中具有很好的临床价值。

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