原癌基因N33在自体移植静脉中表达的实验研究

原癌基因N33在自体移植静脉中表达的实验研究

赵晖魏立春邓芝徽邢壮杰李旭

赵晖魏立春邓芝徽邢壮杰李旭

(大连大学附属中山医院辽宁大连116001)

【摘要】目的研究原癌基因N33在自体移植静脉内膜增生中的动态表达及意义。方法Wistar大鼠56只，将右颈总静脉端-端吻合于同侧颈总动脉建立自体移植静脉模型。术后随机分别于6h、24h、3d、7d、14d、28d、42d相应时间点切取移植静脉，同时取自身对侧正常颈静脉作为对照组。行HE和Masson染色，观察移植静脉的组织病理学变化，并应用免疫组织化学方法检测其相应蛋白表达情况。结果正常静脉内膜和中膜均很薄，由数层细胞排列而成，且未检测到N33的蛋白表达；静脉移植术后3d、7d、14d，内膜增生逐渐明显，原癌基因N33蛋白表达呈明显增强趋势，至术后14d达高峰，此三时相与正常静脉组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；28d后增生内膜厚度及面积趋向减轻，原癌基因N33相应蛋白表达也开始降低，42d后增生内膜厚度和面积较28d进一步减轻，相应蛋白表达强度更低，二者与术后2w比较差异显著（P分别为<0.05和<0.01）；将各时间点中实验组的阳性表达细胞与对照组比较有明显统计学意义（P<0.05）；同一组内不同时间点两两比较，差异均有显著意义（P<0.05）。结论移植静脉内膜早期增生与原癌基因N33的激活表达关系密切，原癌基因N33可能为防治移植静脉内膜增生、狭窄及闭塞的基因治疗提供新的干预靶点。

【关键词】癌基因N33移植静脉内膜增生蛋白表达

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）02-0045-02

动脉旁路转流手术是治疗心血管和周围血管缺血疾病的重要手段之一，目前自体大隐静脉是临床应用最广泛的移植材料，但移植后静脉桥内膜增生及后期的再狭窄、闭塞使手术的一年和十年失效率分别高达15%左右和40%-50%[1]，患者最终往往面临着截肢，严重影响生活质量。解决静脉桥再狭窄这一课题目前是心脏血管外科研究的热点。血管内膜增生作为一种增生性疾病，在分子学机理上，类似于良性肿瘤[2]，我们由此推测，血管内膜增生和类似异常表达的基因关系密切。为了研究移植静脉桥再狭窄的基因表达，我们建立了大鼠颈动静脉自体移植模型，采用相关染色方法观察静脉桥狭窄的病理变化，并应用免疫组织化学染色方法动态检测原癌基因N33的蛋白在增生的血管内膜中的表达情况，旨在从细胞形态学和蛋白质水平探讨N33与血管内膜增生的关系及所起的作用，为临床从基因水平防治静脉移植术后再狭窄提供更坚实的理论依据。

1材料与方法

1.1主要手术器械

SXP-1B型手术显微镜；显微外科手术器械包（宁波成和显微器械厂）；8/0、10/0带线缝合针（宁波成和显微器械厂）。

1.2模型建立Wistar大鼠56只，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002，雌雄不限，体质量300±50g。10％水合氯醛按0.3mL／100g行腹腔注射麻醉。取仰卧位，常规备皮，消毒、铺巾。取右侧胸锁乳突肌前切口，长约3cm，逐层切开皮肤、皮下组织，钝性分离颌下腺，将其上翻，显露并分离颈外静脉，长度约1.5cm。于同侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间牵开肌束，显露颈动脉鞘，注意保护迷走神经及滋养小动脉，游离颈总动脉约2cm。取静脉桥长度约1cm，两断端用8/0无损伤缝线结扎，用肝素生理盐水[3]（含肝素12500U/L，罂粟碱0.12g/L）冲洗管腔，直至管壁发白，无附壁血栓，并置于其中保存留用。颈总动脉两端以无损伤血管夹阻断血流，中间切除0.3-0.5cm，并用肝素盐水冲洗管腔。吻合动脉远心端：将颈动脉远端与颈外静脉分支近心端外膜予以修剪，采用二分法，用8/0无损伤缝线先缝合3点处，结扎后留一短线头用血管夹牵引；用同样方法缝合9点处，牵引；镊子轻拈外膜，自3点至9点将血管前壁间断外翻缝合2～3针，并打结。翻转血管，用同样方法缝合后壁，打结。吻合完毕后可开放，并根据血管充盈和搏动情况及远端勒血试验，来确定血管通畅情况。用同样方法吻合动脉近心端，注意对合时勿让血管扭曲。松开血管夹后迅速用棉球压迫止血，一般压迫1min松开，如再渗血，应加缝1针。术后当天肌注青霉素40万U（或庆大霉素4万U），并给予葡萄糖盐水2d，常规饲养。手术前后均不用抗凝剂。

1.3标本收集

1.3.1实验组标本：分别于术后6h、24h、3d、7d、14d、28d、42d各时间点，按数字标记法随机各取8只动物，麻醉后经原切口找到静脉桥。根据血管充盈和搏动情况判断其通畅性后，血栓形成的血管颜色为暗红色，坏死的血管为苍白色，并呈纤维条索状。于其近远端吻合口上下正常动脉各5mm处完整切取移植静脉桥标本，用肝素盐水冲洗干净，于液氮中冻存。

1.3.2对照组标本：同时取自身对侧正常颈总静脉作为对照组。

1.4检测指标和方法

1.4.1病理组织形态学观察

静脉标本置于10%中性多聚甲醛溶液中固定24h→常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成蜡块→取静脉标本中断切成5um后切片，行HE染色和Masson三色染色→采用盲法由两名经验丰富的病理科医师在光镜下阅片，并通过计算机图像分析系统采集图像，测量增生内膜的厚度和面积。每个静脉段测3张不连续切片取其均值。

血管内膜增生程度按照以下公式计算：

①内膜厚度=（内弹力膜以内周长-血管腔内表面周长）/2π；

②内膜面积=内弹力膜以内的面积-管腔面积

1.4.2原癌基因N33蛋白表达检测

采用SP法免疫组织化学染色进行检测。

1.4.2.1操作程序

静脉标本置于10%中性多聚甲醛溶液中固定24h；常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成蜡块；取静脉标本中断切成5um后切片，置于多聚赖氨酸防脱磨砂玻片上，60℃烤片固定1h。兔抗鼠原癌基因N33多克隆抗体（一抗）稀释度为1：100。DAB显色，苏木精复染，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。同时以对侧正常颈总静脉为自身对照标本。完成后干燥、封片，光镜（10*10倍）下观察。

1.4.2.2免疫组织化学染色结果判读：

细胞核或细胞浆出现棕黄色颗粒沉着为阳性。每份标本随机选取3个部位，计数7个时间点单位视野内阳性表达细胞占总细胞的百分比，结果去平均值。

1.5统计学处理

所有数据经SPSS13.0forWindows统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，同一组内不同时间点比较采用单因素方差分析及q检验，实验组和对照组间同一时间点比较采用配对t检验，检验标准P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有明显统计学意义。

2结果

2.1实验造模情况

解剖分离颈静脉和颈动脉时间15-30min，平均20min；切取修剪静脉桥时间为5-15min，平均7min；血管吻合时间20-60min，平均35min；手术总时间为55-90min，平均为70min。98只大鼠自体颈静脉移植成功80只，成功率为81.63%（80/98）。实验过程失败的原因有：麻醉意外死亡1只，呼吸道分泌物阻塞窒息致死1只，术中操作粗暴触碰迷走神经突发心跳骤停2只，失血性休克死亡1只，吻合口血栓形成或闭塞3只，术后感染致死2只。造模成功后分笼常规饲养。术后定期以触摸颈部动脉搏动来确定血管通畅情况，必要时采用多普勒超声检查。

2.2组织病理学变化

移植静脉桥HE染色和Masson三色染色显示，正常对照颈静脉内膜被覆单层内皮细胞，中膜很薄，只由2-3层平滑肌细胞及少量胶原纤维组成，附着在血管外膜的是大量疏松结缔组织（图a）。移植后3天静脉桥内膜可见受损，内皮细胞脱落，局部有附壁血栓形成，少量炎性细胞浸润，并可见薄层新生内膜形成其厚度可达（8.41±2.23）μm，胶原纤维少量增生，而弹力纤维断裂分布不均，且较正常减少，Masson染色呈蓝色加深（图b）。移植后1周静脉桥内皮细胞排列紊乱，VSMC一定程度增多并向内膜迁移，血管壁可见多量炎性细胞浸润，伴有大量排列紊乱的梭行纤维细胞，静脉内膜可见明显增厚达（16.24±4.46）μm，与术后3天比较，差异有显著性意义（P<0.05）（图c）。在移植后2周，血管内膜基本完成内皮化，内皮细胞覆盖大部分受损的内膜，新生的内膜几乎连成一圈，增生最明显达（32.62±5.43）μm，且有较多层VSMC，表现为核大，深染，排列较整齐，并出现透明状细胞外基质，血管腔明显缩小，与术后1周比较，差异有显著性意义（P<0.01）（图d）。Masson染色显示，术后2周胶原纤维大量增生，管壁呈不规则增厚（图e）。术后4周，管腔进一步缩小，内皮细胞排列较整齐，弹性纤维及胶原纤维增多增粗，多分布于内膜深层，平滑肌细胞密度下降，内膜增厚较2周略减轻达（27.35±6.51）μm，与术后2周比较，差异有显著性意义（P<0.05）（图f）。

3讨论

自体静脉移植后再狭窄机制目前尚不完全明确。目前研究认为[4]，移植静脉桥再狭窄的主要病理特征为内膜的过度增厚。由于游离及吻合血管时，对血管壁的机械损伤以及静脉血管进入动脉血流系统后，血液流速和切变力等血流动力学因素的变化，导致术后早期血管内皮细胞损伤、脱落，再内皮化延迟，诱发血小板及白细胞的粘附、聚集，促使静脉桥血栓形成，进而血管新生内膜增生，其中以吻合口处最明显，最终导致移植静脉桥再狭窄、闭塞。随着分子生物学的迅速发展，基因水平的研究日益成为了医学领域探索的热点，基因与疾病的关系也得到了更加深入的认识。血管内膜增生作为一种增生性疾病，与肿瘤和瘢痕疙瘩等异常增生的病理学特点很类似，目前肿瘤已被归结为基因病，而且有研究报道[5-6]，瘢痕疙瘩组织中有相关癌基因的异常表达。故可以推测血管内膜增生组织中也可能存在着某些异常表达的癌基因，并由这些基因促进血管内膜增生的发生、发展。据国外研究报道[7]，原癌基因N33在增生性病变组织中表达明显增强，特别是在炎症增生阶段。国内学者王珍祥等[2]通过人类基因芯片筛选发现，原癌基因N33与增生性瘢痕组织的关系密切。Ladin等通过实验发现[8]，增生挛缩的瘢痕组织细胞中，原癌基因N33的表达信号强，同时伴有细胞凋亡率的降低。

本实验结果表明，在静脉移植术后的早期（2周内）静脉内膜增生不断明显，原癌基因N33蛋白表达也呈逐渐增强趋势；术后2周之后移植静脉桥内膜增生逐渐减轻，N33基因蛋白表达逐渐变弱，二者呈正相关（相关系数r=lxy2/lxx*lyy=0.5734）。据此作者判断，在血管移植术后早期，原癌基因N33的激活表达很可能与血管内膜增生有密切关联，为进一步干预原癌基因N33的表达来防治移植静脉内膜增生、狭窄及闭塞提供了可能干预的基因靶点。然而，关于它在血管内膜增生性疾病中的作用机理尚待进一步研究探索。

参考文献

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[2]王珍祥，李世荣，吴军.原癌基因N33在增生性瘢痕中的表达的研究[J].《中国美容整形外科杂志》，2007，18（1）：77-79.

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