十八种医院中药制剂微生物限度检验方法的建立研究

十八种医院中药制剂微生物限度检验方法的建立研究

吕伟吴艳艳李树强

（天津市津南区食品药品检验所；天津300350）

【摘要】目的:建立十八种医院中药制剂微生物限度的检查方法。方法：对十八种医院中药制剂采用《中国药典》2015年版四部“1105和1106”项下方法进行微生物限度检查方法适用性试验。结果：根据回收率试验结果，消炎胶囊（III）、消炎胶囊（II）、活血通络胶囊、助孕胶囊（II）、回春壮阳胶囊（IV）、消凝助孕胶囊、助孕胶囊（I）、补肾生精胶囊、健脑益智胶囊、回春壮阳胶囊（III）、固精胶囊11个品种的供试品各试验菌的比值均在0.5～2范围内，证明无抑菌现象；调经胶囊、通精胶囊、止精胶囊、液化胶囊、消炎胶囊（I）、回春壮阳胶囊（I）、除畸生精胶囊有一定程度的抑菌作用，可通过采用稀释法消除抑菌作用。结论：18种中药制剂的需氧菌计数，消炎胶囊（III）等11种制剂可按常规法进行；调经胶囊等7种中药制剂改用1：50供试液进行。霉菌和酵母菌计数、控制菌检查，可按常规法进行。

【关键词】微生物限度检查;中药制剂；方法适用性试验;抑菌作用；方法建立

[中图分类号]R2[文献标号]A[文章编号]2095-7165（2018）24-0231-02

在中药制剂处方中,有些中药材对微生物有一定抑制作用。不同中药制剂的抑菌成分与作用强弱不同,供试品中的微生物在抑菌成分存在下有可能不能检出,为了消除其对微生物的影响,需对每种样品建立适宜的微生物限度检查法。本文依据《中国药典》2015年版四部采用不同方法对十八种医院中药制剂进行微生物限度及控制菌方法适用性试验，为该类药品制定微生物检查标准提供科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器蒸汽压力灭菌器、电子天平、鼓风干燥箱、生化培养箱、霉菌培养箱、生物安全柜、净化台

1.2培养基胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。以上培养基均由青岛高科园海博生物技术有限公司生产，均已通过培养基适用性检查并在使用有效期内，培养基的制备按标示方法制备。

1.3菌种金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]以上菌种均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4样品消炎胶囊（III）、消炎胶囊（II）、活血通络胶囊、助孕胶囊（II）、回春壮阳胶囊（IV）、消凝助孕胶囊、助孕胶囊（I）、补肾生精胶囊、健脑益智胶囊、回春壮阳胶囊（III）、固精胶囊、调经胶囊、通精胶囊、止精胶囊、液化胶囊、消炎胶囊（I）、回春壮阳胶囊（I）和除畸生精胶囊共十八个品种，规格均为0.3g/粒。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1菌液制备

按照《中国药典》2015年版四部通则1105和1106要求制备金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌悬液。

2.1.2方法适用性试验

需氧菌总数

（1）试验组：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。取1:10供试液9.9ml，加入适量浓度的0.1ml金黄色葡萄球菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供试液，取1ml置平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供试液，注皿。

（2）菌液对照组：取适量浓度的0.1ml金黄色葡萄球菌菌液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml，混匀，制成菌含量<100cfu/ml的菌悬液，吸取1ml置平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，注皿。

（3）供试品对照组：取试验组项下1:10供试液9.9ml，加入0.1ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，取1ml置平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。

（4）阴性对照组：取胰酪大豆胨液体培养基1ml置平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。

霉菌和酵母菌总数

（1）试验组：取1:10供试液9.9ml，加入适量浓度的0.1ml白色念珠菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供试液，取1ml置平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。同法制备含黑曲霉的供试液，注皿。

（2）菌液组：取适量浓度的0.1ml白色念珠菌菌液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml，制成菌含量<100cfu/ml的菌悬液，吸取1ml置平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。同法制备含黑曲霉的菌悬液，备用。

（3）供试品对照组：取需氧菌试验组项下1:10供试液9.9ml，加入0.1ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，取1ml置平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。

（4）阴性对照组：取胰酪大豆胨液体培养基1ml置平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。

经试验，消炎胶囊（III）、消炎胶囊（II）、活血通络胶囊、助孕胶囊（II）、回春壮阳胶囊（IV）、消凝助孕胶囊、助孕胶囊（I）、补肾生精胶囊、健脑益智胶囊、回春壮阳胶囊（III）、固精胶囊以上11个品种各试验菌比值均在0.5～2范围内，符合药典要求，结果见表1；调经胶囊、通精胶囊、止精胶囊、液化胶囊、消炎胶囊（I）、回春壮阳胶囊（I）、除畸生精胶囊有一定的抑菌作用，结果见表2，可进一步稀释，采用1：50供试液试验，计数，结果见表3。

表1消炎胶囊(III)等11个品种计数方法适用性试验结果（一）

控制菌检查方法适用性试验

方法适用性试验

1．耐胆盐革兰阴性菌

（1）试验组：取1:10供试液10ml两份,分别加入规定量大肠埃希菌（

不大于100cfu）和铜绿假单胞菌（不大于100cfu），22.5℃培养2小时。取经预培养2小时的1:10预培养物1ml接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时。

（2）阳性菌对照组：取胰酪大豆胨液体培养基10ml两份，分别加入规定量大肠埃希菌（不大于100cfu）和铜绿假单胞菌（不大于100cfu），22.5℃培养2小时。取经预培养2小时的预培养物1ml接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时。

（3）阴性对照组：取胰酪大豆胨液体培养基10ml，22.5℃培养2小时。取经预培养2小时的预培养物1ml接种至10ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时。

分别取两种试验菌的试验组、阳性对照组、阴性对照组上述培养物，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，35℃培养18小时。阳性对照组接种大肠埃希菌的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌生长（菌落形态为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm）；接种铜绿假单胞菌的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌生长。试验组上菌落形态与阳性对照组一致。阴性对照组无菌落生长。

（4）实验结果阳性对照组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌；试验组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。阴性对照组无菌落生长。适用性试验结果符合要求。

2．大肠埃希菌

（1）试验组：取1:10供试液10ml和规定量大肠埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养18小时。

（2）阳性对照组：取规定量大肠埃希菌（不大于100cfu），加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养18小时。

（3）阴性对照组：取胰酪大豆胨液体培养基100ml，35℃培养18小时。

取试验组、阳性对照组、阴性对照组上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，43℃培养24小时。取上述麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，35℃培养18小时。阳性对照组平板上菌落形态为鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。试验组上菌落形态与阳性对照组一致。阴性对照组无菌落生长。

（4）实验结果阳性对照组检出大肠埃希菌；试验组检出大肠埃希菌；阴性对照组无菌落生长。适用性试验结果符合要求。

3．沙门菌

（1）试验组：取本品10g和规定量沙门菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养18小时。

（2）阳性菌对照组：取规定量沙门菌（不大于100cfu），加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养18小时。

（3）阴性对照组：取胰酪大豆胨液体培养基100ml，35℃培养18小时。

取试验组、阳性对照组、阴性对照组上述培养物各0.1ml，接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，35℃培养18小时后，取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上，35℃培养18小时，阳性对照组平板上菌落形态为淡红色、半透明、中心无黑色（部分有黑色）。试验组平板上菌落形态与阳性对照组一致。阴性对照组无菌落生长。

（4）实验结果：试验组检出沙门菌；阳性对照组检出沙门菌；阴性对照组无菌落生长。适用性试验结果符合要求。

经试验，十八种医院中成药制剂控制菌的检查按照常规法进行，无抑菌作用。

4检验结果以上十八种医院中药制剂分别按试验制定的微生物限度方法对样品进行检验，结果均符合规定。

5讨论从需氧菌计数试验结果可以看出，消炎胶囊（III）等18种中药制剂中11种制剂试验菌的比值均在0.5～2范围内，符合药典要求；调经胶囊等7种中药制剂有一定程度的抑菌作用，可改用1：50供试液进行。霉菌和酵母菌计数、控制菌检查，可按常规法进行。18种中药制剂微生物限度检查方法结果见下表：

参考文献

[1]中国药典2015年版.四部[S].2015：140-151

ChP2015.VolⅣ[S].2015：140-151