注射用比阿培南无菌检查方法研究

注射用比阿培南无菌检查方法研究

陈娟1焦吉祥2刘春亮3

陈娟1焦吉祥2刘春亮3

（1南京市浦口中心医院211800)

(2南京先声东元制药有限公司211800)

(3安徽省滁州市食品药品检验所239000）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）22-0090-03

【摘要】目的建立注射用比阿培南无菌检查方法。方法采用酶中和结合薄膜过滤法消除比阿培南的抑菌活性。结果注射用比阿培南的抑菌活性被消除。结论中和结合薄膜过滤法可作为注射用比阿培南无菌检查的常规方法。

【关键词】比阿培南无菌检查薄膜过滤青霉素酶

比阿培南为碳青霉烯类抗生素，具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有很强的抗菌活性，其抗菌活性比亚胺培南强2倍。[1]比阿培南的强抗菌活性在为患者带来福音的同时也增加了其无菌检查的难度。根据《中国药典》2010年版二部附录无菌检查的要求，采用薄膜过滤法进行品种的无菌检查时，每张膜的冲洗量不得过1000ml。然而，比阿培南的抗菌活性过强，普通的薄膜过滤法每张冲膜洗1000ml无法消除其抑菌活性。笔者通过酶中和法与薄膜过滤法相结合，在10每张膜冲洗1000ml以内的条件下成功的消除了残留比阿培南的抑菌活性。

1仪器与试药

1.1仪器

ZW-808型集菌仪（温州市禾子生物实验设备有限公司），一次性全封闭集菌培养器（瑞安市图旺生物技术设备有限公司，批号：20100415）。

1.2试药

注射用比阿培南（南京先声东元制药有限公司），规格：0.3g，批号：92-090510、92-090511、92-090512。铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均来自中国药品生物制品检定所，菌种传代次数均不超过5代。硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红纳琼脂培养基、营养肉汤培养基均购自北京三药科技开发公司。青霉素酶（大于300万单位/ml）购自中国药品生物制品鉴定所，批号：20100106。

2方法与结果

2.1菌液制备[2]

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

2.2培养基适用性检查[2]

2.2.1培养基无菌检查

分别取同批配制的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基5瓶，置规定温度下培养14天，均无菌生长。

2.2.2培养基灵敏度检查

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养3天；取装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。结果见表1。

表1培养基灵敏度检查结果

2.3试验方法及试验结果

2.3.1验证试验1

取样品10瓶，每瓶用500mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解后过滤，冲洗滤膜9次，100/ml，在最后一次冲洗液中加入1ml小于100cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，过滤，最后加入培养基100ml与青霉素酶4ml（大于300万单位/ml），其他各试验菌同法操作，作为试验组。另取相同量的试验菌，除不加样品外与试验组同法操作，作为对照组，置规定温度培养。结果见表2。

表2验证试验1结果

大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉

培养时间24h24h24h24h48h48h

试验组＋＋－＋＋＋

对照组＋＋＋＋＋＋

结果表明，在该试验条件下，比阿培南对枯草芽孢杆菌的抑菌活性无法消除，故以枯草芽孢杆菌为试验菌，重新探索试验条件后进行验证试验。

2.3.2验证试验2取样品10瓶，用含4ml青霉素酶的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解后过滤，冲洗pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液900ml，在最后一次冲洗液中加入1ml小于100cfu的大肠埃希菌，过滤，加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，置规定温度培养。其他试验菌同法操作（白色念珠菌、黑曲霉冲洗后加入改良马丁培养基）。结果见表4。

表3验证试验2结果

大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉

培养时间24h24h24h24h48h48h

试验组＋＋＋＋＋＋

对照组＋＋＋＋＋＋

结果表明，该方法成功消除了比阿培南的抑菌活性。

3结论

以上结果表明，注射用比阿培南（0.3g）的无菌检查可采用薄膜过滤法，用含4ml青霉素酶的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解样品后再用900mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100ml。

4讨论

比阿培南是碳青霉烯类抗生素，对革兰氏阴性和阳性的需氧菌和厌氧菌等均有很强的抗菌作用，临床上可用于呼吸系统感染、尿路感染、腹腔内感染及妇科感染，其中对子宫旁附件炎的有效率可达100%，疗效显著。[3]

然而，比阿培南超强的抗菌活性在为患者带来福音的同时，也为其无菌检查带来了很大难度。根据《中国药典》2010年版附录的要求，注射剂须进行无菌检查，且有抗菌活性的品种用薄膜过滤法进行无菌检查时，冲洗量不得过1000ml。本文试验表明，在常规的试验条件下，冲洗1000ml无法消除比阿培南的抑菌活性。要消除比阿培南的抑菌活性，可行的办法是增大稀释剂体积及冲洗液用量、使用中和剂、选取合适的稀释剂和冲洗液种类、选取适合于抗生素的滤膜等途径。本文中，笔者用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替0.9%氯化钠溶液，同时把稀释剂的用量由200ml提高至500ml，效果显著。另外，青霉素酶的加入对方法验证的完成起了至关重要的作用。一般认为，碳青霉烯类抗生素对青霉素酶不敏感，但是，但青霉素酶对其仍然有一定的中和作用，青霉素酶的加入效果显著。同时，青霉素酶的加入方式也对试验有着很大影响。本文中，将青霉素酶由加至培养基中改为加至稀释剂中，效果明显。

此外，试验操作过程中，冲洗过程中要时时振摇，以将集菌培养器顶部残留的比阿培南冲洗干净，保证冲洗效果。

参考文献

[1]陆宏国，薛春余，徐玉凤等.抗菌药比阿培南[J].药学进展,2003,27(3):186-187.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S]2010年版二部.北京：中国医药科技出版社，2010:附录104.

[3]赵敏，赵国君，张勇.新碳青霉烯类抗生素比阿培南[J].中国临床药理学杂志，2005,21(5):390-392.