肝癌组织中LKB1/AMPK/mTOR信号通路的表达及临床意义

肝癌组织中LKB1/AMPK/mTOR信号通路的表达及临床意义

崔振楠李晓霞白咸勇

（1滨州医学院山东烟台264003）

（2滨州市肿瘤医院肿瘤科山东滨州251700）

【摘要】目的：探讨LKB1/AMPK/mTOR信号通路在肝细胞癌发生、发展中的作用及临床意义。方法：研究分组：肝癌组（67例肝细胞癌组织）、癌旁组（67例肝癌组织相应的癌旁组织，距癌组织5cm以上）及正常肝脏组（32例）。采用免疫组织化学技术检测三组标本中LKB1、AMPK、mTOR的表达水平，并分析LKB1、AMPK、mTOR蛋白的表达与肝癌常见临床病理参数的关系。结果：LKB1在肝癌组中阳性表达率（31.3%）低于癌旁组（53.7%）及正常肝脏组（79.1%）中的阳性表达率，差异有统计学意义（P＜0.05）；AMPK在肝癌组中阳性表达率（25.0%）低于癌旁组（50.8%）及正常肝脏组织中的阳性表达率（73.1%），比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）；mTOR在肝癌组中阳性表达率（75.0%）显著高于癌旁组（53.7%）及正常肝脏组（17.9%）中的阳性表达率，差异有统计学意义（P＜0.05）。在以上三种肝脏组织中，LKB1与AMPK的表达呈正相关(P＜0.01)，LKB1、AMPK与mTOR表达呈负相关(P＜0.01)；临床病理因素分析提示，LKB1、AMPK表达与肝细胞癌的组织分化程度相关，与年龄、性别及病理分期等无关;而mTOR表达则与肝癌的组织分化程度及病理学分期均有关，与患者年龄及性别等无关。结论：肝癌组织中存在LKB1/AMPK/mTOR信号通路的异常激活，提示LKB1/AMPK/mTOR信号通路在肝细胞癌的发生发展中发挥重要作用，为该信号通路作为临床诊疗的分子靶点提供理论依据。

【关键词】肝细胞癌；LKB1/AMPK/mTOR；信号通路；免疫组化

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）36-0062-03

ExpressionandclinicalsignificanceofLKB1/AMPK/mTORsignaltransductionpathwayinHepatocellularcarcinoma.

CuiZhennan1,LiXiaoxia2,BaiXianyong1(Correspondingauthor).

1.BinzhouMedicalCollegeinChina,ShanDongYanTai264003;2.Binzhoucancerhospitaloncologydepartmentshandongbinzhou251700,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectandclinicalsignificanceofLKB1/AMPK/mTORsignaltransductionpathwayinHCC.MethodsAtotalof67casesofHCCtissuesandcorrespondingpara-carcinomatissuesand32casesofnormallivertissueswerecollected.ExpressionofLKB1、AMPKandmTORinsurgicalspecimensweredeterminedbyimmunohistochemistry,respectively.TheassociationofLKB1、AMPK、mTORproteinandclinicopathologicalcharacteristicswerefinallyanalyzed.ResultsPositiveexpressionrateofLKB1intheHCCtissuesgroupwere31.3%,whilepositiveexpressionrateofLKB1intheothergroupswere53.7%,79.1%respectively,andtherewasasignificantdifference(P<0.05);PositiveexpressionrateofAMPKintheHCCtissuesgroupwere25.0%,whichwassignificantlylowerthanthoseinthelivertissuesgroup(73.1%)andpara-carcinomatissuesgroup(50.8%),andthedifferenceswerealsosignificantly(P<0.05).Whatismore,positiveexpressionrateofmTORinHCCtissuesgroup(75.0%)wassignificantlyhigherthanthoseinthelivertissuesgroup(17.9%)andpara-carcinomatissuesgroup(53.7%),andtherewasasignificantdifference(P<0.05).Intheabovethreegroups,LKB1expressionwaspositivelycorrelatedwithAMPKexpression(P<0.01),LKB1expressionandAMPKexpressionwerenegativelycorrelatedwithmTORexpression(P<0.01).LKB1expressionandAMPKexpressionwererelatedtohistologicalgradeofHCC,whichwerenotcorrelatedwithage、sexandpathologicalstaging,whilemTORexpressionwascorrelatedwithhistologicalgradeandpathologicalstagingofHCC,whichwerenotcorrelatedwithageandsex.ConclusionTheLKB1/AMPK/mTORsignaltransductionpathwaywerehighlyactivatedinHCCtissues,indicatethattheLKB1/AMPK/mTORsignaltransductionpathwaymayplayaimportantroleinthedevelopmentprocessofHCC,andcanbeusedasatherapeutictarget.

【Keywords】HCC;LKB1/AMPK/mTOR;Signaltransductionpathway;Immunohistochemistry

肝癌是全球范围内排名第五的恶性肿瘤，也是致死率极高的恶性肿瘤之一，肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常见的一种肝癌类型，占所有肝癌的90%以上。近年来肝细胞癌癌发病呈明显上升和年轻化趋势[1-2]，肝细胞癌的发生、发展及侵袭转移是一个多因素、多步骤的复杂过程，目前对其发病机制尚未完全明了，也缺乏明确有效的早期预防和干预措施。本项研究应用免疫组织化学方法检测LKB1/AMPK/mTOR在肝癌组织、癌旁肝组织和正常肝组织中的表达差异，并分析该信号通路与肝细胞癌常见临床病理参数的关系，旨在进一步阐述LKB1/AMPK/mTOR信号转导通路在肝细胞癌发生、发展中的作用。

1.材料与方法

1.1试剂和材料

收集肝细胞癌组织标本67例、相应的癌旁肝组织标本67例以及正常肝脏组织32例。所有病例术前均未进行过任何形式的抗肿瘤治疗。其中研究组男39例、女28例，平均年龄48.2岁。病理结果为肝细胞癌（其中高分化25例、中-低分化42例），有HBV感染21例、无HBV感染46例。正常肝脏组织组男18例、女14例，年龄47.1岁。三组患者在年龄，性别等方面具有可比性，组间差异具有统计学意义（P>0.05）。一抗LKB1（ab63617）、AMPK（ab32047）及mTOR（ab2732）购于艾博抗（上海）贸易有限公司，SP试剂盒，DAB显色试剂盒均购于美国CellSignaling公司。一抗采用1:200稀释，DAB显色、苏木素复染透明后中性树胶封片，显微镜下观察。PBS代替一抗做阴性对照。

1.2免疫组织化学染色及结果判定

采用SP法，组织切片常规脱蜡至水洗；3％的过氧化氢处理大约10min后，磷酸盐缓冲液轻微冲洗洗3次，每次约5min；进一步加入10％山羊血清封闭液处理15min；加入一抗在37℃条件下处理2h；PBS洗3次，每次5min；生物素标记二抗37℃约20min；PBS轻微冲洗3次，每次持续5min；过氧化物酶(HRP)标记链霉卵白素15min；PBS洗3次，每次5min；DAB显色3min；水洗，苏木精复染、封固。随机选取10个视野，并在每个高倍视野(×400)下分别选择100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数占细胞总数的比例，计算平均值，分别由两位经验丰富的病理科医师双盲阅片，并按肿瘤细胞阳性细胞率和着色强度分别进行记分，(1)按阳性细胞百分率记分：0分为≤5％，1分为5％～25％，2分为25％～50％，3分为50％～75％，4分为>75％；(2)按着色强度记分：分为4个等级，0分为无着色，1分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。两者积分乘积为0表示阴性(-)，≥l为阳性，其中1～3表示弱阳性(+)，4～7表示阳性(++)，8～12为强阳性(+++)。

1.3统计学分析

所有数据资料均采用SPSS17.0统计软件进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

LKB1/AMPK/mTOR在肝癌组织、癌旁肝组织和正常肝组织中表达：LKB1/AMPK/mTOR阳性染色呈棕黄色颗粒，大部分表达于细胞质内。在肝癌组织、癌旁肝组织和正常肝组织中，LKB1阳性表达率分别为31.3%、53.7%及79.1%，组间分别比较差异分别具有统计学意义(P＜0.05)；AMPK阳性表达率分别为25.0%、50.8%及73.1%，三组间差异有统计学意义(P＜0.05)；mTOR阳性表达率分别为75.0%、53.7%及17.9%，三组间分别比较，差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

注：与正常肝组织组比较，aP<0.05，bP<0.01；与癌旁组比较，cP＜0.05。

2.1三组不同肝脏组织中LKB1、AMPK及mTOR蛋白表达的相关性分析：在肝癌组织、癌旁肝组织和正常肝组织中LKB1与AMPK蛋白的表达呈正相关(r=0.757，P＜0.01)，LKB1、AMPK与mTOR表达呈负相关(r=－0.633，P＜0.01；r=－0.578，P＜0.01)。

2.2肝癌患者LKB1/AMPK/mTOR信号通路的表达与常见临床病理参数的关系：对纳入本项研究的67例肝癌癌患者进行相关性分析提示，LKB1、AMPK蛋白的阳性表达与肿瘤的组织学分级关系密切（P＜0.01），而与年龄，性别，病理分期及是否伴有HBV感染无关（P＞0.05）；mTOR蛋白的表达水平高低与患者肿瘤的组织学分级及病理分期均相关（P＜0.01），而与患者的年龄，性别及是否伴有HBV感染无关（P＞0.05，表2）。

3.讨论

LKB1是最近发现的一种新型抑癌基因，位于人的第19号染色体短臂13.3区，LKB1基因有1个非编码的外显子和9个编码的外显子构成，其合成的LKB1蛋白由433个氨基酸构成[3-5]。LKB1蛋白在功能上属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参与调节细胞周期运转、加速糖酵解过程、保护正常细胞的极性水平以及控制血管内皮生长因子的分泌。研究发现，LKB1通过磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK），从而激活AMPK，如Alessi等[6]报道，LKB1可以磷酸化AMPKa亚单位活化环上172位点的苏氨酸，从而激活AMPK。而AMPK与细胞增殖密切相关，活化的AMPK可以激活TSC-2，进而抑制mTOR的表达，mTOR通过对其下游的两个重要靶点S6K及4E-BP1的抑制，使核糖体内蛋白质合成受阻来抑制细胞的增殖。国外学者研究证实，LKB1主要激活AMPK，AMPK磷酸化以后可以促进p53及p21的表达，p21的表达增加能够影响细胞周期调节蛋白CDK及Cyclin结合，减少Cyclin-CDK复合物的形成，从而抑制细胞周期G1向S期的转化，阻滞细胞周期于G1期。此外，将外源性LKB1基因导入无LKB表达的宫颈癌细胞和恶性黑色素瘤细胞中，可导致p21蛋白表达的增加，使细胞周期阻滞于G1期，降低了细胞的分裂增殖[7-9]。天津医科大学研究人员发现子宫内膜癌组织中LKB1和AMPK的表达水平显著低于非典型增生组及增殖期子宫内膜组织中的表达，子宫内膜癌组mTOR表达明显高于非肿瘤组织中该蛋白的表达水平。且LKB1、AMPK表达水平的高低与子宫内膜癌的组织学分级相关，mTOR蛋白的表达则与子宫内膜样腺癌组织学分级及患者是否绝经关系密切，提示LKB1/AMPK/mTOR信号转导通路在子宫内膜癌的发生及发展中发挥重要作用[10]。在本项研究中，我们运用免疫组织化学的手段检测肝细胞癌组织、癌旁组织及正常肝脏组织中LKB1、AMPK及mTOR蛋白的表达差异，并分析此三种蛋白的表达与常见临床病理参数的关系，结果证实，LKB1、AMPK在肝细胞肝癌组织中的表达水平显著低于在癌旁肝组织和正常肝组织中表达水平，mTOR蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于非肝癌组织中的表达，提示肝细胞肝癌中存在异常活化的LKB1/AMPK/mTOR信号通路，而肝癌组织中mTOR的表达水平越高，说明肿瘤细胞中蛋白合成越快，即肿瘤分裂增殖越快，从而进一步加速了细胞的肿瘤化水平。本实验还发现LKB1/AMPK/mTOR信号通路在肝细胞肝癌中的表达与组织学分级或病理分期明显相关，而与性别、年龄、是否伴有HBV感染等无直接联系。

综上，LKB1、AMPK及mTOR在肿瘤细胞恶变、分裂、凋亡及侵袭转移等关键步骤中发挥重要作用，该传导轴上某一个或者几个环节出现问题都会影响肿瘤的发生发展。因此，对LKB1、AMPK及mTOR相关蛋白的进一步研究可能为肝癌的靶向治疗提供一种新的思路。该项研究结果提示LKB1/AMPK/mTOR信号通路的活化在肝细胞肝癌的发生、发展中发挥关键作用，为以该信号通路相关蛋白为靶点的肝癌分子靶向治疗提供一定的理论依据。

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基金项目：山东省医药卫生科技发展项目（编号：2014WS0480）

Fundprogram:MedicalscienceandtechnologydevelopmentprojectofShandongprovince（NO:2016WSA16003）