肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究

肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究

武胜勇

武胜勇

第二军医大学200433

【摘要】目的：筛选肝纤维化相关microRNA，并试分析其功能。方法：制备模型大鼠与正常大鼠，取肝活组织，提取RNA，进行RNA筛选与表达量分析，并测定行CoL-1、CTGF、TIMP-1水平，并进行相关性分析。结果：正常大鼠239个MicroRNA片段，肝纤维化模型大鼠250个，相交片段212个，其中9个存在较大变化，microRNA-138上调表达差异倍数达3.843123；正常组与模型组MicroRNA-138表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1水平差异具有统计学意义（P＜0.0），且存在相关性。结论：microRNA-138可能具有抑制肝纤维化作用。

【关键词】肝纤维化；microRNA；调控

【中图分类号】R331.3+6【文献标识码】A【文章编号】1276-7808（2015）-06-499-01

肝纤维化是指各类损伤因素反复刺激性发生的肝脏病理改变，是各类肝病常见临床表现，具有不可逆性，可进展为肝硬化、肝癌。MicroRNA是一类小分子非编码RNA，参与调控各类细胞生长、分化、凋亡等，研究证实其在肝纤维化发生、进展过程中发挥重要作用。本次研究试筛选肝纤维化相关microRNA，并探讨其在肝纤维化中发挥的功能，以供借鉴。

1资料及方法

1.1研究对象

取健康清洁级雄性大鼠40只，3～4周、体重（150±10）g，常规试验，正常食水。

1.2仪器与试剂

猪血清、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、无水乙醇、中性树胶、TRIzolRRNA提取试剂盒，CR型高速冷冻离心机、制冰机、4℃冰箱、低温冰箱、酶标仪、台式离心机、石蜡切片机、PV扫描仪、，PCR扩增仪IHi-Seq2000高通量测序仪、超净工作台等。

1.3方法

1.3.1实验一

参照陈述所给出方法，制备肝纤维化模型大鼠。分别取5份正常大鼠肝组织、5份模型大鼠肝组织，提取RNA。主要步骤：①-80℃冰箱留存，分批取出；②液氮处理，碾碎，预称重，定量组织100mg，置入离心管；③加入1.5mlTRIZOL，摇匀，室温放置5min，加入0.3ml氯仿，混匀15s，留置2-3min，12000r/min离心，15min，取上清液0.8m；④加入0.7ml异丙醇，室温静置10min，10000r/min，持续10min，弃上企业，加入75%乙醇1.4ml，7000r/min，5min，弃上清液，干燥5min，100mlDEPC灭菌处理，-70℃保存，留用。RNA纯度分析：以infinite酶标仪测定标本，进行样品完整性检测、纯度分析，最后进行表达差异检测。表达定量分析采用去PCR技术检测，77℃-60min接着85℃-5min反应条件逆转录，所得产物以灭菌水稀释后-20℃保存，以SDSRQ7500softwareV2.0软件计算样本Ct。

1.3.2实验二

取正常大鼠40只、肝纤维化模型大鼠40只的肝组织，参照实验一测定表达差异最大的MicroRNA-138表达量，并进行CoL-1、CTGF、TIMP-1水平，并进行相关性分析。

1.4统计学处理

数据资料以SPSS18.0软件处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，若服从正太分布，组间比较采用t检验，若不服从正太分布，组间比较采用非参数检验，相关性分析采用单因素相关性分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1MicroRNA数目差异与表达差异

修剪低质量片段后，正常大鼠肝组织共获得704821个片段，肝纤维化模型大鼠共获得795643个片段，参考SOAP比对程序，结果显示正常大鼠肝组织中3805343个片段存在，肝纤维化模型大鼠中有3705440个片段真实存在。再次对比寻找，正常大鼠肝样本中有239个MicroRNA片段，肝纤维化模型大鼠中有250个MicroRNA片段，相交片段212个，占前者88.70%，占后者84.80%。进行高通量检测，结果显示212个相交MicroRNA片段，有9个存在较大变化，正常大鼠与肝纤维化模型大鼠表达量差异倍数＞2倍，分别是-1、-30b-5p、-144、-451、-674-3p、-27a、-138、-146b、-342-5p，前5个位下调表达，后5个为上调表达，其中-138上调表达十分显著，差异倍数为3.843123。

2.2细胞因子表达

研究显示，正常组与模型组MicroRNA-138表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1水平差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。相关性分析，MicroRNA-138表达量与CoL-1、CTGF、TIMP-1水平均有相关性，r分别为0.818、0.912、0.843、0.82，且P＜0.01，具有统计学意义（P＜0.05）。

3讨论

研究显示，MicroRNA可能为肝纤维化有关，相交片段212个，中有9个表达量差异倍数在2倍以上，占4.25%，其中MicroRNA-138差异最为显著，其与人I型胶原（CoL-1）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶的组织抑制剂（TIMP-1）密切相关，提示MicroRNA-138上调，可能通过以上三种物质抑制肝纤维化，但具体作用机制尚有待深入研究。

参考文献：

[1]王晓军，张荣珍，胡苑笙，等.我国病毒性肝炎流行现状研究[J].疾病监测2004，19（8）：290-292.

[2]陈超.肝纤维化化相关microRNA的筛选及其功能研究[D].上海：第二军医大学，2012.