联合运用RT-PCR与DELFIA技术检测丙型肝炎病毒结果分析

联合运用RT-PCR与DELFIA技术检测丙型肝炎病毒结果分析

韦平宣

韦平宣（广西河池市第一人民医院546300）

【中图分类号】R512.33【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）35-0038-02

【摘要】目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)抗体、HCVRNA联合检测用于丙型肝炎诊断的临床价值，并研究本地区丙型肝炎的感染和流行情况。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HCVRNA、解离-增强时间分辨荧光免疫分析法（DELFIA）定量检测HCV抗体。结果715例初诊为丙型肝炎的患者中，HCV抗体阳性85例（11.89%），HCVRNA阳性107例（14.96%），两者共同阳性76例（10.63%），其中男性49例（64.47%），女性27例（35.53%），主要集中在35-45岁之间。结论单独检测HCV抗体或HCVRNA均有一定的缺陷，二者联合检测可提高丙型肝炎的检出准确率；RT-PCR技术灵敏度较高，对HCVRNA检出率较高。丙型肝炎在门诊就诊者中阳性检出率较高，且以中青年为主，男女性别感染检出率无差异。

【关键词】丙型肝炎病毒RT-PCRDELFIA

丙型肝炎病毒（HCV）感染是引起慢性丙型肝炎的主要原因，80%以上的感染个体会变成慢性肝炎携带者[1]，有很大一部分患者可能会发展成肝硬化和/或肝癌，然而现阶段尚无特效药物和治疗手段[2],所以对早期检出HCVRNA是否存在感染，及时有效阻断其传播是极其必要的。单独检测HCV抗体或HCVRNA均有一定的缺陷[3]，二者联合检测可提高丙型肝炎的检出准确率。我们于2011年6月至2012年1月到本院感染性门诊就诊的715例怀疑为丙型肝炎的患者中，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HCVRNA、时间分辨荧光免疫分析法（DELFIA）定量检测HCV抗体[4],探讨联合应用的价值，并研究本地区丙型肝炎的感染和流行情况，现分析如下：

1对象与方法

1.1研究对象

从2011年6月1日至2012年1月31日来自本院感染性门诊就诊的715例初诊为丙型肝炎的患者中。其中男性429例，女性286例，年龄从15岁到64岁，平均年龄38岁。要求患者被检测前未使用抗病毒治疗或停止病毒治疗。

1.2方法

1.2.1标本采集及保存在无菌操作下采集静脉血，分离血清，及时检测，避免溶血标本。如不能马上检测，应将样本置于-20℃存放。

1.2.2试剂与仪器由新波公司提供的抗HCV时间分辨荧光免疫分析法定量检测试剂盒,WALLAC公司生产Victor2-1420多标记免疫检测仪。Bio-Rad公司生产550型微孔板判读仪（酶标仪）。RT-PCR试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，扩增仪也为该公司的DA7600自动荧光检测仪。全部试剂盒在有效期内。

1.2.3标本处理与检测

715份血清标本均用DELFIA法和RT-PCR法测定，并严格按照操作说明进行，设置阴、阳、空白对照。

1.2.4结果判断HCA抗体用Victor2-1420多标记免疫检测仪进行荧光强度计数，专用软件处理换算成浓度，≤1.00S/CO为HCV抗体阴性，>1.00S/CO为HCV抗体阳性。HCVRNA扩增曲线为标准S形，且目的RNA>1.0×103拷贝/ml为阳性；扩增曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则实验结果判为HCVRNA<1.0×103拷贝/ml即阴性。

1.2.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件对检测结果进行统计学检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果与分析

本次研究可以看出，前来医院就诊715例初诊为丙型肝炎的患者中，其中男性429例，女性286例，年龄从15岁到64岁，平均年龄主要集中在40±8岁。HCV抗体阳性85例（11.89%），HCVRNA阳性107例（14.96%），两者共同阳性76例（10.63%），其中男性49例（64.47%），女性27例（35.53%），主要集中在35-45岁之间。见表1和表2：

表1715例初诊为丙型肝炎的患者中丙型肝炎病毒检出情况

用DELFIA法和RT-PCR法测定丙型肝炎病毒，其阳性检出率比较,x2=413.533,P=0.000<0.05,差异有统计学意义，说明用DELFIA法和RT-PCR法测定丙型肝炎病毒其阳性检出率有差别，RT-PCR法测定丙型肝炎病毒检出率更高。

表276例HCV抗体和HCVRNA均阳性患者情况分析

在男性429例男性中HCV抗体和HCVRNA均阳性为49例，阳性率为11.43%，在286例女性中二者均阳性为27例，阳性率为9.44%，两者率的比较x2=0.709，P=0.400>0.005,差异无统计学意义，说明男女性别在HCV抗体和HCVRNA阳性检出率上无差别，男女易感性相同。从表2可以看出男女性别阳性检出率均集中在30～49岁之间，占82.89%，说明丙型肝炎病毒感染检出率主要集中在中青年阶段。

3讨论

HCV抗体的出现，提示感染过HCV，或是携带HCV病毒能传播丙型肝炎，多数感染HCV病毒患者可无症状，但HCV感染可发展为慢性肝炎、肝硬化，并增加肝细胞肝癌的危险性[5]。此外HCV病毒可通过输血传播，对供血者进行HCV抗体筛查，可明显降低输血后肝炎的感染率[1]。但即使检测出HCV抗体，也并不能一定就说明该患者体内携带了HCV，也不清楚是否具有传染性[6]。HCV抗体检测有一定限制性，包括缺乏早期检测灵敏度，因为HCV感染后存在45至68天窗口期。目前国内许多实验室建立了PCR检测方法并用于临床标本的检测，但却都存在一些问题，主要包括两个方面，即特异性和灵敏度[7],同时HCV是RNA病毒，其RNA极易降解。据有报道表明HCV抗体和HCVRNA联合检测可提高丙型肝炎的诊断准确率[8]。

我们采用PCR与DELFIA技术对临床标本进行联合检测，同时检测出阳性患者76例．但在DELFIA检测抗体阴性标本中有31例RT-PCR检测阳性，说明RT-PCR具有较高的敏感性。文献报道．采用PCR检测方法，可将HCV窗口期缩短41～60d．从而提高HCV阳性检出率[9]。9例RT-PCR检测阴性而DELFIA检测抗体阳性，通过复查排除了实验中污染的可能性，分析原因可能是由于体内HCVRNA虽已清除但抗HCV仍然存在。有报道称HCVRNA测定结果可能有间隙阴性，而抗HCV阳性则基本长期稳定[10]。

4结论

单独检测HCV抗体或HCVRNA均有一定的缺陷，二者联合检测可提高丙型肝炎的检出准确率；RT-PCR技术灵敏度较高，对HCVRNA检出率较高。丙型肝炎在门诊就诊者中阳性检出率较高，且以中青年为主，男女性别感染检出率无差异，应加强对丙型肝炎的早发现、早诊断、早治疗政策。

参考文献

[1]AllainJ-P.HepatitisCvirusinblooddonation[J].Lancet,2005,365:276–278.

[2]吕大回,潘荣明.丙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒RNA联合丙氨酸氨基转移酶检测用于丙型肝炎诊断的临床分析[J].中国医师进修杂志,2012,35(1):43-44.

[3]YongjungPark,Jong-HanLee,BeomSeokKim,DoYoungKim,Kwang-HyubHan,Hyon-SukKim.NewAutomatedHepatitisCVirus(HCV)CoreAntigenAssayasanAlternativetoReal-TimePCRforHCVRNAQuantification[J].JClinMicrobiol,2010,48(6):2253–2256.

[4]顾爱萍，朱雪明，单卫民，王晓明，严桂凤.丙型肝炎病毒抗体的时间分辨荧光分析法检测[J].临床检验杂志,2001,19(4):215.

[5]JingTong,You-weiWang,Yuan-anLu.Newdevelopmentsinsmallmolecularcompoundsforanti-hepatitisCvirus(HCV)therapy[J].JZhejiangUnivSciB,2012,13(1):56–82.

[6]PerilloR，HarmHW，MuthnerD，eta1．AdefovirdipivoxiladdedtoongoingLamnivudineinchronichepatitisBwithYMDDmutanthepatitisBvirus．Gastroenterology，2004，126(1)：81-90．

[7]露楠．李金明，邓巍，等．HCVRNART-PCR测定室问质量评价的研究[J]．临床检验杂志,2000,28(5)：281.

[8]MatthewHoare,WilliamTHGelson,SimonMRushbrook,etal.HistologicalchangesinHCVantibody–positive,HCVRNA–negativesubjectssuggestpersistentvirusinfection[J].Hepatology,2008,48(6):1737–1745.

[9]刘伟雄，王坚，宋正．PCR检测病毒核酸在血制品生产中的应用[J]．中国输血杂志,2004，17：415-417．

[10]徐卫平，施素月，林福地，等．HCVRNA荧光定量PCR法与抗-HCVELISA法的比较[J].中国输血杂志,2005,18：207-208．