酶联免疫法与高分辨气相色谱／高分辨质谱法分析飞灰中二英类的结果比较

酶联免疫法与高分辨气相色谱／高分辨质谱法分析飞灰中二英类的结果比较

黄维民（通讯作者）陈卫海

黄维民（通讯作者）陈卫海（苏州市华测检测技术有限公司江苏苏州２１５１３４）

【中图分类号】Ｒ８３１【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０４２７－０２【摘要】利用Ｍ１２自动净化方法和化学净化方法，分别对六个飞灰样品净化后，使用酶联免疫法对飞灰样品中的二英总量进行检测，将检测结果与化学参考值比较，高浓度样品结果重复性较好，低浓度样品结果的重复性较差。分别取飞灰７和飞灰８样品０．２ｇ和０．５ｇ样品，使用Ｍ１２自动净化方法和化学净化方法后使用高分辨气相色谱．高分辨质谱法检测，检测结果分别为飞灰７（０．５ｇ）：５４．５ｐｇＷＨＯ－ＴＥＱ／ｇ和７６．７ｐｇＷＨＯ－ＴＥＱ／ｇ；飞灰８（０．２ｇ）：９９１３ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇ和１４７０８ＷＨＯ－ＴＥＱｐｇ／ｇ；飞灰８（０．５ｇ）：１０５０１ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇ和１０５６５ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇ，表明Ｍ１２自动净化方法能够为高浓度二英样品提供有效的净化处理。

【关健词】酶联免疫法，飞灰，二英ＤｉｏｘｉｎａｎａｌｙｓｉｓｉｎＦｌｙＡｓｈｂｙＥｎｚｙｍｅＩｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙＣｏｍｐａｒｅｄＷｉｔｈＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＧａｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＳｉｘｆｌｙａｓｈｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｕｓｉｎｇＭ１２ａｕｔｏｍａｔｉｃｃｌｅａｎｕｐｍｅｔｈｏｄａｎｄｃｈｅｍｉｓｔｙｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｄｉｏｘｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒｄｉｏｘｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄａｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅｆｒｏｍＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ，ｗｈｉｌｅａｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙｃｏｕｌｄｂｅｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｌｏｗｅｒｄｉｏｘｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｗｏｒｅａｌｓａｍｐｌｅｓ，ｆｌｙａｓｈ７ａｎｄｆｌｙａｓｈ８，（０．２ｇａｎｄ０．５ｇ），ｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇＭ１２ａｕｔｏｍａｔｉｃｐｕｒｉｆｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄａｎｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅｎａｎａｌｙｚｅｄｂｙＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅ５４．５ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇａｎｄ７６．７ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇｉｎｆｌｙａｓｈ７（０．５ｇ）；９９１３ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇａｎｄ１４７０８ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇｆｌｙａｓｈ８（０．２ｇ）Ｉａｎｄ１０５０１ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇａｎｄ１０５６５ＷＨＯ．ＴＥＱｐｇ／ｇｉｎｆｌｙａｓｈ８（０．５ｇ），ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｅｄｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｃｏｕｌｄｓｕｐｐｌｙｃｏｍｐａｒａｂｌｅｒｅｓｕｌｔｓｔｏＨＲＧＣ／ＨＲＭＳｆｏｒｄｉｏｘｉｎａｎａｌｙｓｉｓｉｎｆｌｙａｓｈｓａｍｐｌｅｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＥｎｚｙｍｅＩｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ，Ｆｌｙａｓｈ，Ｄｉｏｘｉｎ

二英（ＰＣＤＤ／Ｆｓ）是多氯代二恶苯并二恶英和多氯代二苯并呋喃的统称。

具有“致癌、致畸、致突变”三致毒性［１－４］。测定二英的常用方法是高分辨气相色谱．高分辨质谱法（ＨＲＧＣ．ＨＲＭＳ）高分辩气相色谱．高分辨质谱法测定飞灰中的二英类在对样品进行快速溶剂提取后，在加入进样内标后使用高分辩气象色谱．高分辨质谱（ＨＲＧＣ．ＨＲＭＳ）进行定性和定量分析［５］。Ｃａｐｅ二英／呋喃检测系统是用利用酶联免疫吸附的方法测定样品中的二英，本方法包括了样品的前处理，它也是一种生物学快速筛选的方法。酶联免疫法的基础是抗原与抗体的固相化及抗原与抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，有保留酶活性。在测定时，受检样品（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性和定量分析。与ＨＲＧＣ．ＨＲＭＳ这种传统的检测方法相比更简单，更快速并且检测的成本比较低。Ｃａｐｅ二英／呋喃检测系统能够测定不同领域的测定样品，其中包括飞灰［淤泥；土壤；水；食品添加剂，谷物类等等。它被美国ＥＰＡ认可并作为方法４０２５［６］。

本文利用生物酶免疫法和高分辨气相色谱．高分辨质谱法分别对低浓度和高浓度的飞灰样品进行检测，并对传统手工净化和Ｍ１２自动净化的结果、生物酶免疫法和高分辨气相色谱．高分辨质谱法的结果进行比较，为生物酶免疫法和高分辨气相色谱法．高分辨质谱法提供检测基础。１．实验部分实验中使用的正己烷、二氯甲烷、甲苯、壬烷等均为农残级试剂．无水硫酸钠、硅胶及酸性硅胶和碱性硅胶的制备按照本实验室已建立的方法进行。参照以前咱们实验室的文章。

活性炭制备方法：ＣａｒｂｏｐａｃｋＣ（８０／１００ｍｅｓｈ，Ｓｕｂｅｌｃｏ，ＵＳＡ）和硅藻土（Ｃｅｌｉｔｅ５４５，ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）按照１８％比例混合，均匀置于马弗炉中１３０℃烘６ｈ，取出后于干燥器中保存备用。１．１手工净化方法用加速溶剂萃取仪（ＡＳＥ３５０，Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）进行提取，提取液浓缩后经过复合硅胶柱（自下而上：１ｇ中性硅胶、４ｇ碱性硅胶、１ｇ中性硅胶、８ｇ酸性硅胶、２ｇ中性硅胶、１ｃｍ无水硫酸钠，用８０ｍｌ正己烷预淋洗，１００ｍｌ正己烷洗脱）净化，洗脱液浓缩至２ｍｌ左右，再过过活性炭柱（１．５ｇ活性炭／硅藻土，１０ｍｌ甲苯和１０ｍｌ正己烷依次预淋洗，５０ｍｌ正己烷洗脱第一组分，弃掉，８０ｍｌ甲苯洗脱二英组分）。１．２Ｍ１２自动净化方法用１０ｍｌ正己烷预淋洗硅胶柱（ＡＳＣ１５，ＣＡＰＥ，ＵＳＡ），正己烷从柱子底端滴下，将Ｃ柱（ＣＣ２，ＣＰＡＥ，ＵＳＡ）平端口接到硅胶柱底端。

将提取液添加到经过预淋洗的硅胶柱和Ｃ柱上，用３０ｍｌ正己烷洗脱，弃掉。

从硅胶柱上取下Ｃ柱，平口端连接到空柱底部，用６ｍｌ正己烷：甲苯＝１：１混合液洗脱，弃掉。从空柱上取下Ｃ柱，将斜口端连接到同一根空柱上，用１２ｍｌ甲苯洗脱二英组分。１．３ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ分析气相色谱仪为Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ），配备Ａｇｉｌｅｎｔ７６９３（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）自动进样器；高分辨质谱仪为ＡｕｔｏＳｐｅｃＰｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＫ），电离方式为电子轰击源（ＥＩ），电子能量为３５ｅＶ，测定的质谱调谐参数为：分辨率＞１００００；离子源温度：２７０℃；采集方式为电压选择离子扫描模式（ＶＳＩＲ）。

分析色谱条件：色谱柱为：ＤＢ．５ＭＳ（６０ｍ×０．２５ｍｍ．ｉ．ｄ．×０．２５ｕｍ），无分流进样，进样量：１ｕｌ，载气（氦气）流速为１ｍｌ／ｍｉｎ，柱温程序：初始温度为１５０℃，保持３ｍｉｎ，以２０℃／ｍｉｎ的速度升到２３０℃保持１８ｍｉｎ，然后以５℃／ｍｉｎ的速度升到２３５℃，保持１０ｍｉｎ，以４℃／ｍｉｎ的速度升到３３０℃，并保持３ｍｉｎ。２．结果与讨论２．１验证Ｍ１２是否可取代手工净化用于二英ＥＩＡ分析方法中的有效性随机选取已有数据基础的生物、化学分析样品６个的样品进行萃取，样品号分别为飞灰１、飞灰２、飞灰３、飞灰４、飞灰５和飞灰６。得到的萃取产物使用Ｍ１２进行净化，得到６个净化产物。进行二英ＥＩＡ分析。并把结果与前期手工前处理得到的生物和化学数据结果进行比对。结果：对６个飞灰样品运用不同的净化方法得到检测结果表１。

表１不同净化方法的ＥＩＡ分析结果及与ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ结果得对照

２．３在试验１结果中，样品飞灰３结果出现较大的偏差（可能在萃取或净化过程中出现失误），剔除后对其他的数据结果进行分析。Ｍ１２净化得到的数据与人工净化得到的数据进行比较，在样品二英浓度较高时，重复性较好，如样品飞灰１和飞灰２。在样品二英浓度较低时，重复性较差。与ＨＲＭＳ／ＨＲＧＣ结果进行比对可知，半自动预处理方法二英毒性当量结果较人工预处理的准确率要高。２．４由表２和表３可知，Ｍ１２净化方法的回收率均普遍低于化学经典净化方法。由表４和表５可知Ｍ１２净化与化学传统方法净化得到的二英样品总量以及１７种同分异构体浓度均相近，但趋势上低于化学方法所得出的结果。化学方法计算二英浓度的方法为同位素稀释法，根据各同位素的回收率，回推样品浓度。所以虽然ＥＩＡ净化方法的回收率低，但得到的最终结果相差不大。２．５结论通过对试验１和试验２结果的比较，我们发现Ｍ１２自动净化方法相对于化学净化方法的回收率较低，但是使用酶联免疫法检测时，结果准确性较高，因此酶联免疫法更是适合使用Ｍ１２自动净化方法对样品进行前处理。表６对两种检测方法进行了比较。

表６．Ｍ１２自动净化方法＋酶联免疫法与化学净化方法＋高分辨气相色谱．高分辨质谱法对比针对Ｍ１２自动净化方法样

品回收率较低的问题，后续实验室会继续进行洗脱方法改进试验，以提高方法回收率。给予对结果准确性的考虑，我们用相同的前处理方法之后对两种方法进行比较，所以这里对时间和成本的核算指的是最后的测定阶段。同样对２０个样本进行最后测定，生物法只需１．２个小时，质谱法需要大约２０小时生物法的成本更是只有质谱法的１／３。

参考文献［１］Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ．ＳａｌｇｕｅｒｏＰＭ，ＨｉｌｌｂｅｒｔＤＭ，ＲｕｄｉｋｏｆｆＳ，ＷａｒｄＪＭ，ＣｏｎｚａｌｅｚＦＪ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，１４０：１７３．１９７．［２］ＭｉｍｕｒａＪ，Ｙａｍａｓｈｉｔａｋ，ＮａｋａｍｕｒａＫ，ＭｏｒｉｔａＭ，ＴａｋａｇｉＴＮ，ＮａｋａｏＫ，ＥｍａＭ，ＳｏｇａｗａＫ，ＹａｓｕｄａＭ，ＫａｔａｕｋｉＭ，Ｆｕｊｉｉ．ＫｕｒｉｙａｍａＹ．ＣｅｎｅｓＣｅｌｌ，１９９７，２：６４５．６５４．［３］ＰｏｌａｎｄＡ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８２，２２：５１７．５４２．［４］ＳａｆｅＳＨ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８６，２６：３７１．３９９［５］ＵＳＥＰＡ，ＥＰＡＭｅｔｈｏｄ１６１３Ｂ，１９９７［６］ＵＳＥＰＡ，ＥＰＡＭｅｔｈｏｄ４０２５，２００２