痹祺胶囊水提取物促进成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用

痹祺胶囊水提取物促进成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用

张少卓1崔元璐1马晓君2冯其帅1王振寰3

张少卓1崔元璐1马晓君2冯其帅1王振寰3柳占彪1(通讯作者)

(1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地天津300193)

(2.天津同仁堂集团股份有限公司天津300203)

(3.内蒙古农业大学内蒙古呼和浩特010018)

【摘要】目的:研究痹祺胶囊水提取物对成骨细胞MC3T3-E1的作用及其机制。方法:(1)体外培养成骨细胞MC3T3-E1，分为对照组及痹祺胶囊水提取物(0.125，0.25，0.5，1，2，4g·L-1)干预组，48h后，MTT法检测细胞增殖情况(2)培养MC3T3-E1细胞，分为对照组及痹祺胶囊水提取物（0.25，0.5，1g·L-1)干预组，48h后，用RT-PCR检测骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA，骨钙素（OC）mRNA以及碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达。结果:(1)痹祺胶囊水提取物各干预组MC3T3-E1细胞的OD值均明显升高，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。(2)痹祺胶囊水提取物0.5g·L-1组的BMP-2mRNA，ALPmRNA和OCmRNA表达均明显增强，痹祺胶囊水提取物0.25g·L-1组的ALPmRNA和痹祺胶囊水提取物1g·L-1组的OCmRNA表达也明显增强，与对照组比较均有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。结论痹祺胶囊水提取物可促进成骨细胞MC3T3-E1增殖，通过上调BMP-2mRNA，ALPmRNA和OCmRNA的表达，也可促进成骨细胞的分化功能。

【关键词】痹祺胶囊水提取物骨钙素骨形成蛋白-2

【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）23-0226-02

骨质疏松症属于中医“骨痹”的范畴，是一种以骨量减少、骨组织微结构退变、骨力学强度下降及骨折危险性增加为主要特征的骨代谢性疾病[1]，目前尚无有效的治疗药物。因此，刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟，可为骨质疏松症的治疗提供思路和理论依据。本文就痹祺胶囊水提取物对体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响及骨形态发生蛋白-2（bonemorphogeneticprotein,BMP-2）mRNA、骨钙素（osteocalcin，OC）mRNA以及碱性磷酸酶（alkalinephosphates,ALP）mRNA表达的影响进行研究，探讨其对成骨细胞MC3T3-E1的作用及作用机制，从而为探索痹祺胶囊能否治疗骨质疏松症提供一定的实验依据。

1材料

1.1试验药物痹祺胶囊原药粉末，由天津京万红药业股份有限公司提供(批号为301510)，痹祺胶囊水提取物的制备:称取痹祺胶囊原药粉末10g，加入100mL超纯水室温超声提取1h，连续2次，合并提取液，4℃、12000rpm冷冻离心30min，合并上清液，-20℃冷冻8h，然后在冷冻干燥机内冷冻干燥，得到痹祺胶囊水提取物。

1.2细胞株和试剂小鼠早期成骨细胞株MC3T3-E1，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞库。含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖培养基(干粉)，Sigma-Aldrich公司，美国，按照说明书用MilliQ级纯水配制并过滤除菌，2-8℃冷藏保存。

1.3仪器CO2细胞培养箱，Thermo，美国。多功能微孔板分析仪，FlexStation3，MolecularDevices公司，美国。Real-TimePCRSystem，Prism7500，AppliedBiosystemsInc公司，美国。冷冻干燥机，Thermo，美国。一次性针头式滤器，0.22μm孔径，Millipore公司，美国。细胞培养瓶，96孔、48孔、6孔细胞培养板，UV可透分析板，50mL离心管，Corning公司，美国。0.2mLPCR管，0.2mL8-联光学盖PCR管，1.5mL聚丙烯离心管，一次性无RNA酶无菌吸头，Axygen公司，美国。

2方法

2.1细胞培养

MC3T3-E1细胞以含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠及Hepes配方的DMEM高糖液体培养基培养，添加100U·L-1青霉素，100μg·mL-1的链霉素，10%热灭活胎牛血清(HI-FBS)。培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。细胞隔天换液。

2.2成骨细胞鉴定

矿化结节试验：用茜素红(ARS)法染色显示成骨细胞形成的矿化结节，以鉴定成骨细胞具有体外矿化的特性。

2.3痹祺胶囊水提取物对BMP-2mRNA、ALPmRNA及OCmRNA表达的影响

将MC3T3-E1细胞以每孔5.0×106个细胞种植到6孔细胞培养板，培养24h后换液，使细胞充分贴壁后随机分组，分为对照组及痹祺胶囊水提取物0.25，0.5，1g·L-1干预组。对照组换入无酚红DMEM培养基，痹祺胶囊水提取物0.25，0.5，1g·L-1干预组在培养基中分别给予相应浓度的痹祺胶囊水提取物。继续培养48h后，按试剂盒和反应体系的要求将总RNA经反转录成cDNA，设计特异性引物，以β-actin为内参对照，设定相对标准曲线，根据荧光阈值（cyclethreshold,Ct）差异，Real-timePCR检测β-actin和OC，ALP以及BMP-2基因的相对拷贝数，根据OC，ALP和BMP-2拷贝数与β-actin拷贝数的比值，检测OC，ALP和BMP-2基因表达量。

2.5统计学分析

实验数据以x-±s表示，使用OriginPro7.5软件进行数据统计分析并做图。组间比较使用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1成骨细胞鉴定

矿化结节试验：7-10天重叠生长的MC3T3-E1细胞渐渐形成细胞小结，随后胶原堆积及钙盐沉积，最后形成不透光的矿化结节，经茜素红(ARS)法染色后矿化结节呈现明显的红色，确定所分离培养的细胞具有体外成骨的能力。

3.2MTT法检测细胞增殖情况

痹祺胶囊水提取物各干预组MC3T3-E1细胞的OD值均明显升高，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。结果表明，痹祺胶囊水提取物对MC3T3-E1细胞的增殖具有促进作用。

表1痹祺胶囊水提取物对MC3T3-E1细胞吸光度值的影响(x-±s，n=6)

注：与对照组比较，**P<0.01

4讨论

成骨细胞在骨组织形成的过程中主要负责骨基质的合成、分泌和矿化。本实验研究发现体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1具有体外成骨的能力，痹祺胶囊水提取物对体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖具有促进作用，通过上调BMP-2mRNA，ALPmRNA和OCmRNA的表达，也可促进成骨细胞的分化功能，进而刺激骨组织的形成，从而揭示有必要对痹祺胶囊水提取物进行是否具有体内抗骨质疏松症作用的进一步研究，从而为探索痹祺胶囊是否能治疗骨质疏松症提供一定的实验依据

参考文献

[1]GiustiA,BianchiG.Maleosteoporosis[J].Reumatismo.2014,66(2):136.

基金项目国家科技支撑计划项目（2007BAI47B04）