固相萃取高效液相色谱法测定头孢噻利血药浓度

固相萃取高效液相色谱法测定头孢噻利血药浓度

黄士兰叶茂伟

黄士兰叶茂伟（广西灵山县人民医院药剂科535400）

【中图分类号】R978.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）15-0074-02

【摘要】目的建立测定血清中头孢噻利（抗生素）浓度的高效液相色谱法。方法以G18柱（HypersilC184.6mmX200.0mm，10um）为色谱柱，流动相为乙睛一磷酸二氢钾缓冲液（9：91），流量为0.8ml•min-1，检测波长为236nm；血清样品上固相萃取（SPE）柱，以10%冰乙酸甲醇溶液为洗脱剂，于65℃水浴下氮气吹干后进样测定。结果头孢噻利血清样品线性范围为0.92～117.28mg•L-1）方法回收率分别为100.92%，101.48%，104.31%，日内，日间RSD均小于5%。结论本方法准确性好，灵敏度高，操作简便，可满足头孢噻利血药浓度监测和药代动力学研究的要求。

【关键词】头孢噻利血药浓度高效液相色谱法

【Abstract】ObjectiveToestablishaHPLCmethodfordeterminationtheconcentrationofcefoselisSulsateinorserum.MethodsTheanalysiswasconductedwithHypersilC18column(4.6mmX200.0mm,10um)。Acetonitrile-potassiumdihydarogenphosphate(9:91)wasservedasmobilephase,theflownumberwas0.8ml.min-1,andthedetectingwavelenghwasat236nm,Serumsanplewasappliedtosolidphaseextraction(SPE)column,andtheelutingagentwas10%acetieacidcolonial,solution,Theeluantwascollectedandwasdridein65℃waterbathwithnitrogengas.Resultthelinearrangeofcefoselissulsateinserumwas0.92～117.28mg.L-1、Therecoveryrateoflowconcentration,moderateconcentrationanehighconcentration(4.69，23.45,46.90mg•L-1)was100.92%,101.48%,104.31%,respectively.Bothoftheintra-dayandinter-dayRSDwerelessthan5%.ConclusionThismethodisaccurate,sensitiveandsimple,Anditissuitablefordeterminationtheconcentrationofcefoselissulsateinserumandthepharmacokineticstudyofcefoselissulsate

【Keywords】cefoselissulsateplasmaconcentrationHPLC

硫酸头孢噻利（cefoselissulsate）是第四代头孢菌类抗生系[1]，本品抗菌谱广，对细菌性肺炎，慢性支气管炎、急性支气管炎及脓胸等具有良好的临床和细菌学疗效。目前国内外关于硫酸头孢噻利血药浓度的测定方法。主要有微生物法，荧光偏振免疫法和高效液相色谱法。但是，微生物法耗时太长，荧光偏振免疫法虽然测定1次血药浓度花费时间较短，往往需等标本凑足一定数量后才能进行检测，且每次检测费用较高，也限制了其在临床上的应用。高效液相色谱法专属性强，准确度高，更适合硫酸头孢噻利血药浓度监测。

材料与方法

1、药品、试剂与仪器

硫酸头孢噻利对照品，批号：40871RS090103江苏豪森药业股份有限公司生产。乙腈、色谱纯，批号：090704，上海豪申化学试剂有限公司生产；无水磷酸二氢钾，批号：070628，天津市光夏精细化工研究所生产；磷酸，批号：070425，天津市福晨化学试剂厂生产；正常空白人血清，实验室自制；0.9%氯化钠注射液，批号：091110-23，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司生产，10%冰乙酸甲醇溶液，实验室自制（取冰乙酸10ml，加色谱纯甲醇90ml混合）；灭菌蒸馏水，批号：1004151C，安徽双鹤药业有限责任公司生产：1100高效液相色谱仪，包括G1311A-四元泵、G13222-脱气机，G1313A-柱温箱及G1314A-UV紫外检测器，美国Agilent公司产品。

2、样品测定

2.1色谱条件

色谱柱：HypersilG18(4.6mmX200.0mm,10um)流动相为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液（磷酸二氢钾6.80g，加入超纯水1000ml，磷酸调PH至3.2，经0.45um微孔滤膜过滤）=9：91；流量为0.8ml•min-1；柱温为25℃；检测波长为236nm；进样量为20ul.

2.2溶液液的配制

精密称取硫酸头孢噻利对照品25.8mg,于10ml容量瓶中，加重蒸馏水制成2580mg•L-1储备液；再用重蒸馏水稀释储备液，配制浓渡为10.1,20.2，40.3，80.6，161.2，322.5,645.0，1290.0mg.L-1标准系列水溶液。

2.3样品处理

量取血清样品0.5ml，置SPE固相萃取小柱，待沥干后，用0.9%氯化钠注射液2ml上柱进行淋洗，弃去淋洗液，将SPE小柱于3000r•min-1离心2min,用10%冰乙酸甲醉溶液4ml上柱洗脱，收集洗脱液于65℃水溶中，用氮气吹干后，用流动相0.5ml溶解，取20ml进行测定。

结果

1、专属性

在上述色谱条件下，硫酸头孢噻利的保留时间约11min，血清中的内源性杂质对其测定没有干扰。

2、标准曲线制备

取空白血清1.0ml，依次加入硫酸头孢噻利系列标准水溶液0.1ml，配制成硫酸头孢噻利浓度分别为0.92，1.83,3.66，7.33,14.66,29.32,58.64,117.38mg,L-1的系列工作血清样品，按“样品处理”项下的方法操作，制备标准曲线。以待测物峰面积A为横坐标，待测物浓度C为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，得直线，回归方程为C=6.24×10-2A+7.31×10-2,r=0.9997(n=8)。最低定量浓度为0.92mg•L-1。

3、方法回收率

取空白血清2.0ml，加入硫酸头孢噻利0.2ml的标准水溶液，配制成低、中高浓度分别为4.69，23.45,46.90mg.L-1,硫酸头孢噻利血清样品各5份，按“样品处理”项下的方法操作。每日取各浓度样品5份，连续测定3d，以标准曲线运算方程计算样品实测浓度，与配制浓度比较，计算低、中、高各浓度方法收率及其日内，日间精密度，结果见表1。

表1硫酸头孢噻利血清方法回收率与精密度

Table1TherecoveryvateandprecisonofCefoselissulsate

4、稳定性

硫酸头孢噻利对照液，取室温保存的20.2mg.L-1硫酸头孢噻利标准深液，分别在第1，2，4，6d进样测定，记录峰面积，结果峰面积的RSD为1.37%，表明硫酸头孢噻利对照液在室温下至少在6d内稳定。另取20.2mg•mg•L-1硫酸头孢噻利标准液2份，其中1份直接取样测定，另一份密塞后置65℃水溶中加热120min取出，恢复至室温温后进样测定。比较两者的峰面积，结果峰面积的RSD为0.87%，表明65℃条件下，2h内硫酸头孢噻利不含发生降解。

血清样品：配制浓度分别为4.69，23.45,46.90mg•L-1硫酸头孢噻利血清样品各3份，置-20℃冷冻72h取出待其融化至室温后，按“样品处理”项下的方法操作，按标准曲线方程计算实测浓度，结果分别4.72(100.64%),23.29(99.32%),47.50(101.28%)mg•L-1表明血清样品冷冻保存3d，不会引起硫酸头孢噻利浓度改变。

讨论

本实验发现，纯甲醇洗脱能力极有限，只能将20-25%硫酸头孢噻利从SPE柱上洗脱下来。为此本文采用冰乙酸甲醇溶液作洗脱剂。由于冰乙酸在甲醇这种非水溶剂中酸性大大增强，故易将硫酸头孢噻利从SPE柱上洗脱。且本洗脱剂不含水份，蒸干操作耗时较短，分别比较了10%，50%及80%，3种浓度的冰乙酸甲醇溶液的洗脱能力，结果发现，三者的洗脱能力相当；但10%冰乙酸甲醇溶液洗脱剂所耗蒸干操作时间最短，故最终以10%冰乙酸甲醇溶液作为本实验洗脱剂。

文献报道[2，3]，分别用40℃及50℃水浴下进行洗脱液齐蒸干操作。为节省操作时间，本实验考察了硫酸头孢噻利在65℃水浴下硫酸头孢噻利的稳定性。结果表明不会导致硫酸头孢噻利的降解，故采用65℃条件下蒸干洗脱剂。

研究者[3]曾采用20%偏磷酸，作为蛋白沉淀剂纯化血样，测定硫酸头孢噻利血清浓度，但由于蛋白沉淀对硫酸头孢噻利的部分吸收及内源性杂质干扰，该方法的最低检测限只能达2mg•L-1，对于硫酸头孢噻利血清谷浓度的检测有一定的局限性。本研究采用固相萃取法纯化血样，将最低检测浓度提高到1mg•L-1左右，适合硫酸头孢噻利血清谷浓度的测定。

参考文献

[1]仲琰,邢为藩.第4代头孢菌素—硫酸头孢噻利[J].国外医药—抗生素手册，2000，21:75-79.

[2]BackesDW,AboleneenHI,Simpson,etal,Quantitationofcefoselissulsateanditscrystallinedegradationproduct(CDP-1)inhumanserumbyhighperformanceliguidchromatography[J],JpharmBiomedAnal,1998;16:1281-1287.

[3]zhangT,WatsonDG,Azikec,etal,DeterminationofcefoselissulsateinserumbyliguidChromatography-highresolutionfullscanmassspectromety[J],JchromatogrB,2007:857:354-356.