氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究

(整期优先)网络出版时间:2010-08-18
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氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究

陈立江1段洪云1张胜2郝爱军1刘洋1

陈立江1段洪云1张胜2郝爱军1刘洋1

(1辽宁大学药学院辽宁沈阳110036;2辽宁省药物研究院辽宁沈阳110015)

【中图分类号】R284.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)08-0086-02

【摘要】目的研究氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺。方法采用HPLC法测定三七总皂苷的含量,考察洗脱剂的浓度、洗脱剂的用量和吸附剂用量对工艺的影响。结果确定最佳精制工艺为:洗脱剂的浓度为55%乙醇,洗脱剂的用量为10倍吸附剂的用量,吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。结论通过氧化铝柱层析精制后,三七总皂苷的收率大于70%,含量大于80%,说明此精制工艺是可行的。

【关键词】三七总皂苷氧化铝高效液相法

三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎[1],三七总皂苷是中药三七的有效部位,主要含有三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1等达玛烷型三萜皂苷类化合物[2]。现代药理研究证明:三七总皂苷具有多方面的生物活性,主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[3]。

目前三七总皂苷的富集与纯化一般采用大孔吸附树脂来完成[4],纯化后三七总皂苷的含量达到60%以上。为了提高药物的安全性和有效性,提高其成药原料药的纯度。本实验拟采用氧化铝柱层析对三七总皂苷的纯化物进行精制[5],并对工艺进行了考察,为进一步的制剂学研究打下基础。

1仪器与试药

1.1仪器与设备

RE52-99旋转蒸器(上海亚荣生化仪器厂);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);JA-1003型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限医疗设备厂);美国Tsp高效液相色谱仪;TspP-2000泵、TspUV-1000UV-VIS检测器;TspPC1000色谱工作站;色谱柱:ODSC18柱(250×4.6mm,5μm,大连依利特科学仪器有限公司)。

1.2材料与试剂

三七总皂苷提取物(云南玉溪天然药物有限公司);三七总皂苷对照品:三七皂苷R1(0745-200008)、人参皂苷Rg1(0703-200015)、人参皂苷Rb1(0704-200115)对照品(中国药品生物制品检定所);乙腈为色谱纯,水为二次蒸馏水。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱:ODSC18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:A为乙腈,B为水;流速:1.0mL·min-1;采用梯度洗脱法,0~8分钟(26:74),8:10~40:40分钟(34:66);检测波长203nm;柱温:30℃;进样量20μL。

2.2线性范围关系的考察

分别精密称取三七总皂苷对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各约6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。精密吸取上述对照品溶液各注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积,以峰面积(A)对进样量(μg)进行线性回归,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回归方程分别为:A=327127.8W-681.2(r=0.9991);A=406964.1W+787.9(r=0.9991);A=262563.9W-5498.7(r=0.9996),三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂Rb1分别在进样量0.2981~0.6956μg、1.2768~2.9792μg和1.1539~2.6925μg范围内时,峰面积与进样量具有良好的线性关系。

2.3精密度试验

取含量测定项下对照品溶液,连续进样六次,记录色谱图,量取峰面积,计算平均值及相对标准偏差,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积平均值分别为151792、802039.7和476940.7,RSD分别为0.81%、1.73%和1.62%,结果表明,本方法精密度良好。

2.4供试品溶液的制备

取上柱流出液浓缩至干,精密称定干粉一定量,用甲醇溶解并转溶至10mL量瓶,滤过。精密量取续滤液1mL置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.5工艺参数的考察

2.5.1洗脱剂浓度的考察

取三七总皂苷原料3份,每份10g。分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱(中性氧化铝50g,内径4cm,干法装柱),然后分别用35%、55%和75%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,减压回收乙醇,真空干燥,按HPLC法测定总皂苷含量和收率。

从以上结果可知,当用75%乙醇洗脱时,总皂苷含量最高,但收率太低,而用55%乙醇洗脱时虽然收率比用35%乙醇洗脱时略低,但总皂苷含量高6%左右,因此,洗脱剂确定为55%乙醇。

2.5.2洗脱剂用量考察

取三七总皂苷原料3份,每份10g。分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱(中性氧化铝50g,内径4cm,干法装柱),然后用55%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,减压回收乙醇,真空干燥,按HPLC法测定总苷含量和收率。

从以上结果可知,随着洗脱剂用量的增加,得到总皂苷的含量逐渐下降,考虑收率,以10倍量55%的乙醇洗脱比较合适。

2.5.3吸附剂用量考察

取三七总皂苷原料3份,每份10g。分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱(柱1:中性氧化铝25g,内径2cm;柱2:中性氧化铝50g,内径4cm;柱3:中性氧化铝100g,内径5cm),然后用10倍量55%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,减压回收乙醇,真空干燥,按HPLC法测定总苷含量和收率。

从以上结果可知,随着吸附剂氧化铝用量的增加,收率逐渐降低,而含量呈上升趋势,氧化铝用量为5倍与10倍相比较,前者虽然总皂苷含量略低,但已经大于80%,而且收率较高,因此吸附剂氧化铝的用量确定为5倍。

2.6中试验证结果

取三七总皂苷原料3份,精密称取质量分别为44.4g,42.8g和47.9g,分别用50%乙醇适量溶解,分别转移至氧化铝柱,中性氧化铝用量为三七总皂苷的5倍,然后用10倍量55%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,在60℃以下减压回收乙醇,真空干燥,按HPLC测定方法,分别测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。

从以上三批中试结果可知,按选定的精制工艺可以制备总皂苷含量大于80%的三七总皂苷原料,且收率大于70%,说明此精制工艺是可行的。

3结论

3.1氧化铝柱层析精制三七总皂苷的最佳工艺为:洗脱剂的浓度为55%乙醇,洗脱剂的用量为10倍量吸附剂的用量,吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。

3.2本实验提出了一种新的三七总皂苷的精制方法—氧化铝柱层析,具有分离效果好、工艺简单、投资少、处理量较大等优点。有文献报道[6],大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附容量大、安全无毒、再生容易等优点,但由于应用时间相对较短,还存在着一些问题,因此,在纯化中药有效成分的工艺过程中,两种纯化方法可以互相结合,取长补短,共同促进中药制剂的不断发展。

参考文献

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2005年版二部[S].北京:化学工业出版社,2005:9.

[2]甘烦远.三七的化学成分研究概况[J].中国药学杂志,1992,27(3):128.

[3]ChanP,TomlinsonB.AntioxidantefectsofChinesetraditionalmedicine:focusontrilinoleinisolatedfromtheChineseherbsanchi(Panaxpseudoginseng)[J].JClinPharmacol,2000,40(5):457.

[4]孙建平,崔淑霞,等.大孔吸附树脂富集三七总皂苷的工艺研究[J].黑龙江医药,2007,3(20):232-233.

[5]柳叶.氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优化[D].浙江大学硕士学位论文.杭州:浙江大学,2006.

[6]胡军,周跃华,等.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用[J].中成药,2002,24(2):127-130.

基金项目:辽宁省教育厅科学技术研究项目(项目编号20060357):沈阳市科学技术计划项目(项目编号1081248-1-00);辽宁‘百千万人才工程’培养经费资助;同时本文得到辽宁大学“211工程”三期建设项目-天然产物化学制药项目的资助。