PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

张霞

（太原市第四人民医院山西太原030053）

【摘要】目的：探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。方法：对2015年8月到2016年8月期间，在我院收治的96例肺结核患者进行研究。采用PCR-SSCP法，对50株MTL型临床分离株进行测试。同时，进行常规的药敏实验。然后，对比检测的结果。结果：在96例肺结核标本中，有54份被检出为MTL型，占56.3%，包括42例人型结核分支杆菌，12例牛型结核分支杆菌。在药敏试验中，将50株MTL型临床分离株作为研究对象。其中，有24株敏感，耐药率为52%。通过PCR-SSCP分析中，显示21例为阳性，检出率为42%。在恢复试验中，显示21株rpsL基因突变株中，15株依然对利福平有耐药性，占到71.4%。29株rpsL基因阴性株中，有26株恢复为细菌性，占到89.7%。结论：对50株MTL型临床分离株进行测试后，有24株对利福平产生耐药性，占52%。21株显示阳性，检出率为42%。根据药敏结果，以及PCR-SSCP法，得出的两种办法的符合率为80.9%。

【关键词】结核分支杆菌L型；rpsL；耐药基因；PCR-SSCP；检测；分析

【中图分类号】R450【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）33-0180-02

结核病是危害人类生命健康的传染病，给患者带来了严重的身心伤害，尤其是耐药结核病。利福平作为杀菌药物，成为抗结核化疗方案之一。然而，受到耐药株、结核分支杆菌的影响，降低了治疗效果，结核病的治疗带来了很大障碍[1]。因此，医生必须引起重视，并采取有效的措施，以此来提高治疗效果。本文的目的在于探讨耐药基因突变以及L型耐利福平的关系。对我院在2015年8月到2016年8月期间，收集的的96份痰标本进行研究，采用PCR-SSCP法，对50株MTL型临床分离株进行测试。现报告如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

对2015年8月到2016年8月期间，在我院收治的96例肺结核患者进行研究。分析患者的痰标本，总计96份。患者的年龄在34岁到68岁之间。其中，男性85份，女性11份。本次研究所用的MT质控菌株为H37Rv。该菌株是由当地的卫生鉴定部门提供的。现报告如下。

1.2方法

1.2.1准备试剂准备好试验需要的试剂。包括：利福平、MTL型液体培养基（92-3TB-L液体培养基）、细菌型普通液体培养基（92-3-TB液体培养基）。以上试剂均从当地的微生物研究院采集。其中，利福平试剂的产地在美国，由BD公司生产。

1.2.2引物设计根据MT染色体DNA重复保守序列，设计引物。重复序列为：IS6110(GenbankL08011)。碱基序列：上游为：5'-ACACCACCACTCCGAAGAAG-3'。下游为：5'-TGCGTATCCAGCGAACCG-3'。生产地：上海。产物大小为：201bp。

1.2.3鉴定结核分支杆菌L型采用无菌操作，鉴定结核分支杆菌的L型。首先，提取2～3ml晨痰。然后，加入酚红指示剂（0.1～0.2ml），氢氧化钠（2～3倍）。经滴管吹吸后，将其混合均匀。保持温度为37℃，进行水浴消化。待15分钟后，取出适量沉淀物，放入到TB-L液体培养基中接种。均匀混合后，依然将温度设置在37℃。培养时间为1～3周。接种第三天后，密切观察培养基的生长现象。MTL型多为沉淀型生长。提取沉淀物涂片后，采取改良IK抗酸染色法镜检。[2]取出改良IK抗酸染色阳性的MTL型液体培养沉淀物，剂量为0.1ml。然后，将其接种到两种培养基中，分别是PNB-MTB-L、TCH-MTB-L。温度保持在37℃。接种第三天后，密切观察，一周观察3次。针对阴性的，要求观察到第四周。针对硝基苯甲酸来说，均可抑制牛型与人型MT生长。同时，在抑制MT生长中，也可以单独使用噻吩-2羧酸肼。然而，针对非结合分支杆菌来说，则不被抑制。

1.2.4常规药敏试验在常规药敏试验中，应用绝对浓度间接法。待成功接种后，保持温度为37℃。培养时间为1～3周。培养第三天起，密切观察培养基的生长情况，查看底部有无生长情况。平均一周时间，观察3次。然后，取出沉淀物涂片，采用改良IK抗酸染色法镜检。如果结果显示阴性，则要观察到第四周。

1.2.5结核分支杆菌L型恢复试验根据相关参考资料，实施结核分支杆菌L型恢复试验。首先，对MTL型菌液进行接种，然后进行培养。将MTL型菌液与92-3TB液体均匀混合后，放置到37℃的环境中。培养时间为1～3周。接种后第三天起，一周观察3次。然后，取出沉淀物涂片，采用IK抗酸染色法进行镜检。如果显示阴性，则观察到第四周。

1.2.6制备DNA对标本进行灭火处理，提出DNA后，再进行制备。最后，实施PCR扩增，并分析DNA单链构象多态性分析。

1.2.7扩增PCR根据当地生物研究所中的25μ反应体系，扩增PCR。然后，提取12-15μ扩增液。将其均匀混入到电泳加样液中，进行密切观察。如果出现黄色条带，那么被试验的结核分支杆菌L型则呈阳性。

1.2.8DNA单链构象多态性分析从临床分离株、标准株中，分别提取出PCR扩增产物10μ1。然后，按照相同的体积，将其混合到甲酰胺变性液中。温度为95摄氏度。变性5分钟，水浴2分钟。此时，在样品中加入非变性聚丙烯酰胺凝胶，剂量为100g/L。按照试验的要求，温度为15℃以下，400V电泳，待12小时后，取出胶板。最后，采取银染法染色，密切观察结果。PCR产物变性后，呈现为两条单链，电泳后为两条单链带。当单链位置与标准株H37Rv单链位置出现差异时，就是运动变位。根据以上变化，可以对基因的突变做出准确的判断。

1.3统计学方法

将上述统计数据录入到SPSS19.0统计学软件中，其中计数资料采取率（%）表示，组间率对比采取χ2检验或t检验；对比以P＜0.05表示结果差异明显，具有统计学意义。

2.结果

2.1结核分支杆菌

在96例肺结核标本中，有54份被检出为MTL型，占56.3%，包括42例人型结核分支杆菌，12例牛型结核分支杆菌。

2.2药敏实验结果

在药敏试验中，将50株MTL型临床分离株作为研究对象。其中，有24株敏感，耐药率为52%。

2.3PCR-SSCP分析

rpsL基因的扩增产物为201bp片段。另外，将标准株H37Rv的rpsL基因扩增物作为对比，进行PCR-SSCP分析。结果显示，21例为阳性，检出率为42%。

2.4基因突变与耐药性关系

对比PCR-SSCP分析与药敏试验的结果，二者的符合率为80.8。

在恢复试验中，显示21株rpsL基因突变株中，15株依然对SM有耐药性，占到71.4%。29株rpsL基因阴性株中，有26株恢复为细菌性，占到89.7%。

3.讨论

利福平是现阶段治疗肺结核的主要抗结核化疗方案用药之一。其作用机制为：与依赖于DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程。耐RFP是由于其作用靶分子RNA聚合酶β亚单位的编码基因rpoB突变所致。专家经过大量的研究工作，得出的结论为：当16sRNA编码基因，或者核糖体蛋白S12编码基因的影响，一旦发生基因突变后，则使MT产生耐药性。此时，rpsL基因上单碱基发生置换。大部分突变点主要在43位密码子上，并有513位或512碱基插入。如果这些碱基发生突变后，就会使其耐药性提高[3]。

本组研究中，对50例肺结核患者进行研究。这些患者均属于分支杆菌L型感染。其中，有24例患者对利福平产生耐药性。21例患者出现rpsL基因突变，占42%。与MT细菌性检出率相比，稍微比较高，但是并不突出。经分析，其主要原因为：由于rpsL发生基因突变后，导致MTL型耐药利福平。除此之外，当rpsL的基因突变株恢复后，依然对利福平具有耐药性。主要原因在于：细胞壁处于缺失状态时，形成了结核杆菌的耐药性。一旦这些缺失的细胞壁被修复后，那些不稳定的L型则重新恢复了对利福平的敏感性[4]。一般情况下，利福平耐药后的稳定性较强，且利福平耐药试验结果可靠性较高。对于临床用药有指导价值，以便于医生及时调整抗结核治疗方案，提高抗结核治疗疗效。

综上所述，对50株MTL型临床分离株进行测试后，有24株耐对利福平产生耐药性，占52%。21株显示阳性，检出率为42%。根据药敏结果，以及PCR-SSCP法，得出的两种办法的符合率为80.9%。

【参考文献】

[1]邱媛，陶峰，孙爱华.PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变[J].中国微生态学杂志，2013，15（05）:571-573+576.

[2]李栋梁，侯瑞生，王侃，李辉，杨红毅，高三友.PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药基因突变分析[J].中国卫生检验杂志，2014，30（21）:3127-3128.

[3]程晓东，于文彬，苏明权，等.多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因[J].第四军医大学学报，2013，24(9):849-851.

[4]吴雪琼，钟敏，张俊仙，等.PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变[J].临床检验杂志，2014，18(01):9-11.