载羟基喜树碱微泡超声造影剂的制备研究

载羟基喜树碱微泡超声造影剂的制备研究

盘捷周玉生李荣许时丽陈临溪

1南华大学附属第二医院2南华大学湖南衡阳市421001

【摘要】目的：对微泡超声造影剂的制备方法进行研究探索，应用超声乳法结合SPG微膜乳化器法制备载羟基喜树碱的微泡超声造影剂，通过体内外实验检验载药微泡的超声显影效果和药物控缓释效果。方法：应用超声乳法结合SPG微膜乳化器法制备载羟基喜树碱的微泡超声造影剂，体内外实验检验载药微泡的超声显影效果和药物控缓释效果。结果：超声乳法结合SPG微膜乳化器法制备的载羟基喜树碱微泡超声造影剂，在粒径大小上适合超声显影及使用安全性的需求，在新西兰大白兔心脏超声造影中呈现良好的显影效果，同时能够顺利通过肺循环使左心室充盈成像。结论：超声乳法结合SPG微膜乳化法制备超声微泡造影剂具有更好的均匀度，适合于载药超声造影剂的制备。

【关键词】微泡造影剂；靶向给药系统；药物控缓释；SPG微膜乳化技术

靶向给药系统（targetingdrugdeliverysystems，TDDS）能将药物定向输送到治疗部位，提高治疗部位的药物浓度，减少药物用量，降低不良反应，提高药物的安全性、有效性和患者的顺从性，是目前抗肿瘤治疗领域研究的重点[1-3]。

超声空化效应是强超声在液体中引起的一种特有的物理现象，含有气体的超声造影剂在超声作用下产生压缩和膨胀现象[4，5]。在高声压时，微泡产生非对称性收缩和膨胀，呈非线性背向散射，并易导致微泡破坏；在这一过程中，微泡作为空化核产生空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁和组织间隙，发挥靶向治疗作用[6-10]。因此，超声造影剂可以作为一种靶向药物治疗的载体。

超声辐照用以增强各种药物传递及其治疗功效的研究近年来受到广泛关注。Loverok等[11]发现，一些药物（如羟基喜树碱）和细胞同时接受超声辐照之后，传递药物的药性和治疗功效可以显著增高。Umemura等[12]报道，使用超声辐照载有卟啉（抗肿瘤药物）的微泡后发现，药物对肿瘤的治疗功效明显提高。

本文对微泡超声造影剂的制备方法进行研究探索，应用超声乳法结合SPG微膜乳化器法制备载羟基喜树碱的微泡超声造影剂，通过体内外实验检验载药微泡的超声显影效果和药物控缓释效果。

1.实验方法

1.1.包裹羟基喜树碱PDLLA微泡的制备

参照第二章超声波初乳法结合微膜乳化法制备PDLLA微泡的实验结果，载药微泡制备流程如下：超声作用下，将含不同浓度羟基喜树碱的内水相以1：10的比率，用注射器匀速加入到0.025g/mlPDLLA的二氯甲烷中，制备成稳定的初乳液。

清洗并装好SPG膜，检测SPG膜乳化器各阀透过性，关闭相应阀门，打开循环泵，使外水相在SPG膜管内腔循环流动。

将初乳液加入膜乳化器的压力舱中，盖好舱盖，通过N2减压阀和进气阀门调节压力舱内压力到50kpa左右，关闭进气阀，打开压力舱下端的阀门，使初乳液匀速通过SPG膜分散到外水相中，形成复乳液。复乳液制备期间，每间隔3min快速打开膜乳化器的进气阀门并快速关上，使压力舱内压力保持恒定。当外水相逐渐出现乳白色浑浊乳液直到不再加深后，关闭压力舱下端的阀门、通气阀及循环泵，将复乳液转移到磁力搅拌器中，100rpm/min40℃过夜搅拌，让二氯甲烷充分挥发。在4℃，3000g条件下离心收集微泡沉淀，蒸馏水洗涤3次后，真空冷冻干燥微泡，使水及二氯甲烷完全升华，获得干燥的白色粉末状微泡样品。

1.2载药微泡粒径测定

称取载药微泡50mg，溶解于2ml氯化钠注射液中，用ZETASIZER测微泡粒径大小及分布。

1.3载药微泡表面形态观察

取少量微泡粉末，涂层与双面胶一侧，另一侧固定于扫描电子显微镜的载物台上，真空镀金20s，扫描电子显微镜15kv高压观察5000倍及10000倍下载药微泡表面形态并拍照。

1.4羟基喜树碱吸收波长扫描及浓度/A414nm标准曲线制备

羟基喜树碱吸收波长扫描：以pH9.0NaOH溶液为空白，对2mg/ml羟基喜树碱pH9.0NaOH溶液在200nm-800nm内的吸收波长扫描，确定羟基喜树碱的最佳检测波长。

1.5载药微泡包封率、载药率的计算。

包封率：准确称取微泡粉末50mg，溶于500µl二氯甲烷中，用500µlpH9.0的NaOH溶液萃取，10000rpm/min室温离心10min，吸取取上清夜，用紫外可见分光光度计在414nm处测定吸光度，以羟基喜树碱浓度/OD414nm标准曲线计算各萃取液中羟基喜树碱浓度，计算微泡的载药率和包封率。

1.6载药微泡体外释药曲线

体外自然释药实验：精确称取50mg载药微球，将其分散在10ml生理盐水中，在37℃，100rpm条件下恒温振荡，0.5h、3h、24h、72h、一周后各取样0.5ml，离心取上清液，在414nm处测定吸光度，根据标准曲线得到羟基喜树碱的浓度，计算出自然释药累积量。

1.7高效液相色谱（HPLC）法制备羟基喜树碱浓度/A414nm标准曲线及血液中浓度/A414nm标准曲线。

羟基喜树碱浓度/A414/266nm标准曲线：用pH9.0NaOH溶液配制下列浓度的羟基喜树碱溶液：2µg/ml、10µg/ml、20µg/ml、30µg/ml、40µg/ml和50µg/ml。

以洗脱相A：洗脱相B=70：30为洗脱液，上样量为20µl，洗脱时间为10min，以266nm和414nm为检测波长，以峰面积对浓度作标准曲线，计算浓度与相应波长吸收值的标准曲线。

1.8载药微泡体内释药曲线

以2.5kg新西兰大白兔为实验动物，0.5mg/mlHCPTpH9.0NaOH溶液为对照，1mg/ml载药微泡为实验组，各经左耳缘静脉注射0.5ml，并分别在以下时间点：0min、3min、5min、10min、15min、30min、60min、120min、180min、960min和1440min，用1ml注射器对两只兔子经右耳缘静脉采血0.5ml，立即装入医用EDTA.2K抗凝采血管中4°C保存。

在4°C，3000g条件下离心5min沉淀血细胞，吸取血清100µl逐滴加入300µl乙腈沉淀蛋白，充分混匀后，超声5min，10000rpm/min，室温离心10min，吸取200µl上清，室温真空抽干后再用50µlpH9.0NaOH溶液溶解，取20µl上样。以洗脱相A：洗脱相B=70：30为洗脱液，洗脱时间为10min。以414nm为检测波长，计算峰面积，通过标准曲线计算血药浓度，并以时间为横坐标，血药浓度为纵坐标，作载药微泡及对照组的体内释药曲线。

1.9载药微泡造影剂体内超声显影实验

称取PDLLA载药微泡0.2g，装于15ml胶盖玻璃瓶中密封，盖子上插一根6号注射针管以供气体通过，将玻璃瓶放置于双颈三角瓶中，双颈三角瓶分别接上真空泵和C3F8，真空泵抽去瓶中空气后，打开装有C3F8容器的气阀，对微泡充气，反复三次使载药微泡中完全充满C3F8气体。

将充气后的载药微泡溶于10ml生理盐水，配制成浓度为0.02g/ml的载药微泡混悬液。以2.5kg新西兰大白兔为实验对象，采用德国SIEMENS公司ACUSONSequoia512彩色多普勒超声成像仪，所用变频探头为8V3C，中心频率5.0MHz，探测深度50mm，成像条件CardiacLVO，帧频43－44Hz，增益5dB。取心尖四腔心切面，记录基础状态下图像待图像满意后经耳缘静脉快速注射造影剂1ml，观察造影剂充盈时段并存图。

2.结果与分析

2.1载药微泡粒径测定

参照PDLLA微泡的制备方法制备的羟基喜树碱载药PDLLA微泡，其粒径大小与同法制备的非载药PDLLA微泡相近。羟基喜树碱的加入没有改变微泡的粒径。制备的载药微泡粒径分布于1-7µm之间，平均粒径为4.5µm，适合超声造影剂的要求（如图1）。

2.2载药微泡表面形态观察

载药微泡的扫描电子显微镜图（图1）显示载药微泡表面光滑，微泡圆整，与非载药微泡在表面形态上没有明显差异。

3.讨论与小结

超声乳法结合SPG微膜乳化器法制备的载羟基喜树碱微泡超声造影剂，在粒径大小上适合超声显影及使用安全性的需求，在新西兰大白兔心脏超声造影中呈现良好的显影效果，同时能够顺利通过肺循环使左心室充盈成像。

在药物控缓释实验中，该载药微泡无论在体外还是在体内都具有较好的缓释效果，比非包裹药物具有更长时间的恒定药物释放量，同时，药物的突释浓度远低于非包裹药物，因此，用PDLLA为囊材制备载药控缓释微泡具有可行性。

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基金项目：湖南省高等学校科学研究项目（12C0372）

作者简介：

盘捷，硕士，主管药师，研究方向：药理学，E-mail：810176182@qq.com.通讯作者：周玉生，主任药师，教授，硕士生导师，研究方向：药理学，E-mail：yszhou@126.com