环氧氯丙烷预处理去细胞猪主动脉瓣防钙化作用实验研究

环氧氯丙烷预处理去细胞猪主动脉瓣防钙化作用实验研究

宿学家1张慧颖3易定华2魏旭峰2张志勇1

宿学家1张慧颖3易定华2魏旭峰2张志勇1

（1解放军第88医院心胸外科山东泰安271000)

(2第四军医大学西京医院全军心血管病研究所心血管外科陕西西安710032)

(3泰安军分区干休一所山东泰安271000）

【摘要】目的观察去细胞过程及环氧氯丙烷预处理（EC）对猪主动脉瓣纤维结构的影响，探讨EC对去细胞猪主动脉瓣钙化的抑制作用。方法实验分为三组：新鲜瓣叶组（F组）：新鲜猪主动脉瓣未作任何处理。去细胞瓣叶（A组）：以胰酶消化，TrintonX100漂洗法去除瓣叶的细胞成分。EC预处理去细胞瓣叶（E组）：以2％的EC/PBS溶液预处理去细胞猪主动脉瓣48h。以电子万能拉力计测定各组瓣叶的断裂强度。傅立叶变换红外光谱仪测定各组瓣叶的游离羧基、酰胺基团变化。原子吸收法测定SD幼年大鼠皮下埋藏8周后钙含量，vonkossa染色观察钙沉积。结果1、A组的断裂强度与F组比较没有明显的差异（619±98.9g/mm2vs632±89.8g/mm2p＞0.05），E组较F组稍有增加（799±37.4g/mm2vs619±98.9g/mm2p＜0.05）。2、红外光谱图显示：F组瓣叶在1700~1750cm-1波长范围（游离羧基的特征性吸收光谱）内没有明显的吸收峰，A组吸收峰深大，而E组又有明显的回落。在1600～1650cm-1范围内（酰胺基的特征性光谱）F组吸收峰明显，A组吸收峰回落，E组吸收峰介入两者之间且较前两者均左移。3、体内埋藏2周后各组瓣叶钙含量开始增加，到达第六周时，新鲜瓣膜组钙含量有显著增加。去细胞瓣膜组增加缓慢，而经EC处理去细胞瓣膜组钙含量始终维持较低水平。4、vonkossa染色显示：F组瓣叶被破坏吸收，未见有新的细胞生长，有大量钙化斑存在。A组及E组瓣叶均可见大量的新细胞生长，前者仅出现散在的微小钙化灶，后者未见有明显的钙化灶。结论去细胞后瓣叶的机械强度没有明显减低，游离羧基有明显的暴露，酰胺基团减少。经EC预处理可封闭游离羧基，增加酰胺基团含量，使瓣叶结构紧密，增加去细胞瓣叶的机械强度，具有减缓钙化的作用。

【关键词】组织工程瓣去细胞钙化环氧氯丙烷

【中图分类号】R966【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）12-0045-03

Effectofacellularcaninevalvepretreatedwithepichlorohydrinonanti-calcification

SuXue-Jia1,ZhangHui-ying3YiDing-Hua2,WeiXu-Feng2.ZhangZhi-yong11.DepartmentofCardio-ThoracicSurgeryof88Hospital,PLA.ShandongTaian,271000.2.DepartmentofCardiovascularSurgery,XijingHospital,ForthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an,710032.3NO1SanatoriumofTai’anMilitarySubarea.ShandongTaian,271000

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectofacellularandpretreatedwithepichlorohydrin(EC)onstructureofcanineaorticvalvefibrinousscaffoldandinvestigatetheanti-cailcificationofEC.METHODS:Thisstudywaspidedthreegroups:Freshvalvegroup(F),thevalvewasnottreated.Acellularvalvegroup(A),thevalvewereacellularedbytrypsogenandTritonX100.AcellularvalvepretreatedwithECgroup(E),acellularvalvewaspretreatedwithEC/PBS48h.Fracturetensionwasmensuredbyomnipotentpulldynamometer.Freecarboxylandacyl-aminewretestedbyFourierinfraedspectrometer.Calcificcontentofvalveafterimplantedsubdermalwasmensuredbyatomicabsorbtionpectroscopy.Calcificaldepositionwasobservedbyvonkossastaining.RESULTS:1.ThefracturetensionofAgroupwasnotdifferentfromFgroup(619±98.9g/mm2vs632±89.8g/mm2p＞0.05）.InEgroup,thefractruretensionwasstrongerthanAgroup（799±37.4g/mm2vs619±98.9g/mm2p＜0.05）.2.Oninfraredspectrum,noabsorbpeakappearedinwavelengthof1700cm-1to1750cm-1whichwaseigenvalueoffreecarboxyl,whileoneabsorbpeakappearedsignificantlyinAgroup.InEgroup,theabsorbpeakinthiswavelengthwaslowerthanAgroup.Inwavelengthof1600cm-1to1650cm-1whichwaseigencalueofacyl-amine,theabsorbpeakofFgroupwasdeeperthanAgroupwhilethatofEgroupwasbetween.AandFgroups,andthepositionofabsorbpeakinEgroupwasleft-movedthanAandFgroup.3.Calcificcintentofeverygroupvalveswasincreasedbegin2weeksafterimplanted.InFgroup,itwasincreaseddistinctlywhichwasincreasedslowly.But,inEgroupthecalcificalcintentwasmaintainedlowerlevel.4.Invonkossastaining,Fgroupvalvewasdestroyedandabsorbedandnoneofnewcellsgrewintoit.AmassofcellsgrewintoAandEgroupvalve.DispersemicrocalcificalnodswerefoundinAvalvebunotinEvalve.CONCLUSION:Themachinicaltensionwasnotdecreasedafteracellular,butthefreecarboxylexposedandacyl-aminedecreased.AfterpretreatedbyEC,themachinicaltensionofvalvehigherthanfreshandacellularvalve,freecarboxylwasblockedoutandacyl-amineincreasedwhilestructureofEvalvewastighterthanAandFvalve.

【Keywords】tissueengineeringvalveaceelularcalcificationepichlorohydrin

引言

组织工程瓣膜的出现为改善生物瓣膜的钙化和衰败带来了极大的希望，但作为生物瓣膜的一种，仍不能完全摆脱钙化的困扰[1，2]。在组织工程瓣膜的构建过程中，诸多因素均可影响其植入体内后的钙化。关于组织工程瓣膜构建过程中的防钙化研究尚未见报道，在构建组织工程瓣的过程中考虑到防钙化措施的干预十分必要。本实验观察了环氧氯丙烷处理的去细胞猪主动脉瓣支架材料的防钙化作用。

1材料和方法

1.1材料：猪主动脉瓣：无菌下取处死2h内猪主动脉瓣，置于4℃Hank’s液保存留作备用。试剂：环氧氯丙烷（EC）购自西安化学试剂厂，胰酶、TrintonX100购自GIBCO公司。

1.2方法：

1.2.1分组：实验共分3组，新鲜瓣膜组（F组）：新鲜猪主动脉瓣叶未作任何处理。去细胞瓣组（A组）：无菌条件下，以胰酶消化，TrintonX100漂洗法去除瓣叶的细胞成分，经组织学及提取DNA鉴定细胞成分去除完善。EC预处理去细胞瓣组（E组）：将去细胞猪主动脉瓣置于2％的EC/PBS溶液中浸泡48h后，无菌PBS液反复漂洗去除瓣叶表面的残留EC备用。

1.2.2断裂强度测定：每组取瓣叶5枚，以测量显微镜测定每组瓣叶的厚度，用特制的哑铃状切刀制成瓣叶片，以Instron1122型电子万能拉力计测定瓣叶的断裂强度。

1.2.3瓣叶游离羧基测定：每组选取瓣叶3例，冷冻干燥后，平铺于AUATAR360型傅立叶变换红外光谱仪分析槽内，扫描频率为波长400～4000cm-1，分辨率取4cm-1，扫描方式为表面全反射法，经对数处理转化成吸收(A)光谱，分析三组瓣叶的结构特征。

1.2.4体内埋藏钙化测定：每组取20枚瓣叶剪成0.5cm2大小叶片，平均分成4组，自头部向尾部方向以F、A、E组顺序植入20只3周龄SD幼年大鼠背部皮下，经腹部皮下注射维生素D促进钙化，分别于2、4、6、8周取材，经50℃烘干72小时，原子吸收法测定钙含量。

1.2.5vonkossa染色：取皮下埋藏8周后瓣叶，4％多聚甲醛固定，切片，行vonkossa染色。

1.2.6统计分析：所有数据均以-x±s表示，以SPSS软件进行统计分析，以P＜0.05为相差显著。

2结果

2.1断裂强度测定：去细胞处理后瓣叶在周长方向上的断裂强度与新鲜瓣叶比较没有显著的差异（619±98.9vs632±89.8g/mm2p＞0.05）。经EC处理后去细胞瓣叶的断裂强度稍有增加（799±37.4vs619±98.9g/mm2p＜0.05）。

2.2傅立叶红外变换光谱分析瓣叶结构：文献表明[3]傅立叶变换红外光谱下游离羧基基团的特征性波长范围为1700～1750cm-1。本实验中红外光谱显示在此范围内新鲜瓣膜组未见有明显的吸收峰，去细胞后在1744.50cm-1处有一个明显的吸收峰出现，而经EC处理后去细胞瓣叶在1743.12cm-1处的吸收峰明显回落。光谱图中还有些峰位是与梭基含量无关，但可以看出酰胺基团的一些变化：去细胞后酰胺基团一方面在含量上低于新鲜瓣叶，另一方面在位置上也较新鲜瓣叶略有右移（1638.55vs1635.37cm-1），而经EC处理后，酰胺在含量上介于两者之间，且在位置上亦较两者有明显的左移（1642.41cm-1）。

图1傅立叶变换红外光谱分析三种瓣叶结构

Fig1Structureof3groupvalveanalyzedbyFourierinfraedspectrum

2.3体内埋藏钙化测定：大鼠皮下埋藏2周各组钙含量开始增加，到达第六周时，新鲜瓣膜组钙含量有明显的增加。去细胞瓣膜组增加缓慢，而经EC处理去细胞瓣膜组钙含量始终维持较低水平（表2）。

表1三种瓣叶幼年SD大鼠皮下埋藏钙含量测定比较(-x±s，ug/g）

3讨论

机械心脏瓣膜置换后需要终生抗凝治疗，由此而带来的栓塞或出血并发症使得机械瓣膜的应用日趋减少。而生物瓣膜由于其无需终生抗凝治疗，减少了由此而引起的栓塞和出血等并发症，在全球范围内应用日趋增多，而且年龄亦日趋年轻化[4]，但生物瓣膜的衰败和钙化特点又大大限制了其进一步的应用。人们曾期待组织工程瓣的出现能达到明显防止或减轻生物瓣膜的钙化，但这仅是问题的一个方面。另一方面在构建组织工程瓣时，种子细胞的分离培养以及瓣膜支架降解和重塑过程中还可能出现创伤、缺氧及营养缺乏等种种非生理环境，均可导致钙盐沉积。文献[1,2]已有报道，应用脱细胞的异种和同种主动脉瓣构建的SynergraftTM组织工程瓣，应用于临床中早期即出现严重的钙化和穿孔，导致严重的后果。可见尽管脱细胞过程去除了由于细胞成分引起的炎性和免疫反应，减轻了由于这两方面引起的钙化和衰败，但去细胞过程对瓣膜支架材料的影响可能又会导致引起其钙化的另一因素。因此对去细胞瓣膜材料进行修饰，维持其结构的完整性，可能起到防止或延缓其移植体内后的钙化作用。

本实验室早在上世纪90年代初期即对生物瓣膜的钙化机制进行了大量的研究工作[5，6]，指出经戊二醛处理的猪主动脉瓣游离羧基的暴露及其与钙的结合是导致其钙化的主要因素，同时筛选出环氧氯丙烷可有效的封闭由于戊二醛的处理而暴露的游离羧基，使此生物瓣膜的钙结合能力减低317倍，研制出经环氧氯丙烷处理的新型防钙化生物瓣广泛应用于临床。受到这一启发，我们提出去细胞过程是否使瓣膜纤维蛋白支架的完整性受到破坏，引起游离羧基的暴露而导致钙盐的沉积。本实验表明，应用傅立叶变换红外光谱分析法发现新鲜瓣膜材料游离羧基接近饱和的水平，光谱图中在游离羧基的特征性波长范围内（1700～1750cm-1）未发现有明显吸收峰出现。去细胞瓣膜材料光谱图显示在1744.50cm-1处有一个明显的吸收峰，提示去细胞过程使瓣膜纤维蛋白支架的游离羧基得到暴露。经环氧氯丙烷处理后，在这一范围内的吸收峰（1743.12cm-1）明显回落，进一步验证了环氧氯丙烷对游离羧基的封闭作用。体内钙化实验显示，经EC处理的去细胞瓣膜8周后钙含量仅为未经处理瓣膜的1/10（表1），vonkossa钙染色发现去细胞瓣叶内散在有大量的微小钙化灶，EC处理的去细胞瓣叶未见有钙化灶（图2）。尽管光谱中新鲜瓣叶未见游离羧基的吸收峰，其钙含量却很高，瓣叶结构破坏严重，存在有钙盐沉积斑块。其原因可能是免疫反应和炎性反应导致大量的炎性细胞侵润，释放大量的炎性介质，吸收破坏瓣叶结构，同时瓣叶本身细胞成分死亡，形成钙盐形成的核心，导致钙盐沉积。

本实验光谱图结果还发现三种瓣叶酰胺基团发生了变化：去细胞后酰胺基团（黑粗箭头所示）一方面在含量上低于新鲜瓣叶（吸收峰明显低于新鲜瓣叶），另一方面在位置上也较新鲜瓣叶略有右移（1638.55vs1635.37cm-1），而经EC处理后，酰胺基团在含量上介于两者之间，且在位置上亦较两者有明显的左移（1642.41cm-1）。说明EC与氨基也有一定的结合，使瓣叶的结构更加紧密一些，一方面使脱细胞的猪主动脉瓣在力学性能上更加耐受血液动力学，另一方面也可能减缓了由于瓣叶的微小断裂损伤导致的钙沉积。这一结果解释了三种瓣叶在断裂强度上的变化。

4小结

本实验结果表明，去细胞过程可以明显减轻异种（猪）主动脉瓣的免疫炎性反应，减轻由此而引起的体内瓣叶破坏和钙化，但这一过程同时对瓣叶纤维支架的完整性有一定的破坏作用使游离羧基含量增加，仍然存在钙盐沉积的机会。经EC处理后一方面有效封闭了去细胞瓣叶游离羧基的暴露，减缓了钙盐的沉积。另一方面也与氨基有一定的胶联作用，使去细胞瓣叶的力学性能更加符合于血液动力学。

参考文献

[1]SimonP,KasimirMT,SeebacherG.EarlyfailureofthetissueengineeredporcineheartvalveSYNERGRAFTTMinpediatricpatients.EurJCardiothoracSurg,2003,23:1002-1006.

[2]WilhelmMH,RebeP,LeyhR,WilhelmM.Roleofinflammationandischemiaafterimplantationofxenogeneicpulmonaryvalveconduits:Histologicalevaluationafter6to12monthsinsheep.IntJArtOrg,2003,26,(5):411-420.

[3]邓勃，宁永成，刘密新.仪器分析，清华大学出版社，北京.1990年，第一版，281－282.

[4]KanekoT,ArankiS,JavedQ,etal.Mechanicalversusbioprostheticmitralvalvereplacementinpatients<65yearsold。JThoracCardiovascSurg.2014Jan;147(1):117-26.

[5]YiDH,LiuWY,WangZW.Experimentalstudyandclinicalapplicationsofanti-calcificationalbioprostheticheartvalve[J].Zhonghuashiyanwaikezazhi,1993,10(4):182-183.

[6]魏旭峰易定华.环氧氯丙烷处理生物瓣膜组织防钙化机制的进一步研究.中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)，2005.06：1-131