下调NF-KB／p65的表达对小鼠移植瘤细胞Bcl-2和Bax的影响

下调NF-KB／p65的表达对小鼠移植瘤细胞Bcl-2和Bax的影响

曲耘张晓晔吴荣

1中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤科沈阳110000；2.中国医科大学附属盛京医院第四肿瘤科沈阳110000

【摘要】目的：研究利用p65siRNA下调NF-κBp65表达后，对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞组织Bcl-2和Bax的影响。方法：采用Lewis肺癌细胞C57BL/6雄性小鼠移植瘤细胞悬液，建立小鼠移植瘤模型。将NF-KB／p65siRNA接种荷瘤小鼠，应用荧光定量-PCR和Wstern印迹法观察下调NF-κB／p65表达后，肿瘤组织中Bcl-2和BaxmRNA及蛋白表达的变化。结果：经p65siRNA治疗后，p65siRNA组小鼠肿瘤组织中P65、Bcl-2的mRNA及蛋白表达明显降低而Bax的mRNA及蛋白表达明显升高。差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：下调NF-κB/p65的表达，进而抑制Bcl-2表达，处进Bax的表达是使小鼠瘤细胞明显发生凋亡的分子机制之一。说明NF-κB/p65亚基可能在Lewis肺癌细胞凋亡中发挥重要作用，NF-κBp65因子可能在未来肺癌的靶向治疗中是一个很好的分子靶点。

【关键词】NF-κBp65；Lewis肺癌；凋亡；siRNA；移植瘤；Bcl-2；Bax.

EffectonexpressionofBcl-2andBaxmRNAofnudemouselungtumourcellxenograftsbydownregulationNF-κBp65

QuYun1，ZhangXiaoye2，WuRong1

1TheSecondDepartmentofOncology，2TheForthDepartmentofOncology，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，39#TengFeiRoad，Shenyang110003，LiaoNingProvince，China

[ABSTRACT]Objectiv：Toinvestigatetheeffectsofexpressiondownregulationofnuclearfactor-kappaB（NF-KB）／p65ontheexpressionsofapoptosis-relatedgenesBcl-2andBaxinnudemouselungtumourcellxenografts.Methods：AnudemouseLewislungcarcinomacellxenograftmodelwasestablished，andthemicewereintraperitoneallyinjectedwithNF-κBp65siRNAandsacrificedafter2weeksoftumourcellinjection.TumourxenograftswereharvestedforWesternblotandquantitativereversetranscription-polymerasechainreactionanalyses.Results：LevelsofP65andBcl-2mRNAandproteinintumourxenograftsweresignificantlydownregulatedbutBaxwassignificantlyupregulatedinp65siRNA-treatedmicecomparedtothePBSortheNCmice..Conclusion：KnockdownofNF-κBp65subunitexpressionsignificantlydownregulatedproteinP65andBcl-2expressionwhilesignificantlyupregulatedproteinBaxexpressioninP65siRNAgroup.TargetingNF-κBp65subunitexpressionasapotentialtherapeuticstrategyneedsfurtherevaluationintreatinghumanlungcancer.

Keywords：NF-κB；Lewislungcancer；apoptosis；smallinterferingRNA；xenografts；Bcl-2；Bax

由于大气污染、雾霾、吸烟等不良因素的日趋加重，肺癌的发病率、死亡率也不断上升，居于所有癌症的首位[1]。对于就诊时已属中晚期的肺癌患者放化疗是主要的治疗方法[2]，由于放化疗抵抗和副作用[3]，他们已经不能满足患者的需要。人们迫切地要找到一种新的行之有效的治疗肺癌的新方法。

肿瘤的发生、发展取决于瘤细胞存活与凋亡之间的平衡。NF-κB是一种核转录因子，在肿瘤发生、发展中起重要作用，对肿瘤细胞凋亡的作用尤其显著。此因子通过抑制细胞凋亡加速肿瘤的生长[4-8]。NF-κB传导通路通过调控许多下游凋亡基因例如（Bcl-2andBax）等来控制细胞凋亡。近来越来越多的研究表明NF-κB通路在肿瘤发展中起重要作用[9]。有研究显示，NF-κB与肺癌关系密切[10]。所以靶向阻断NF-κB传导通路对肺癌的治疗有重要意义[11-12]。例如：阻断NF-κB通路可提高肺癌对化疗的敏感性[13]。

本实验通过给予裸小鼠腹腔注射P65siRNA来评估抑制NF-κBp65表达对小鼠移植瘤细胞影响的分子机制，并为靶向抑制NF-κB活性对治疗肺癌是一个好方法提供证据。

1材料与方法

1．1细胞培养首先将冻存的Lewis细胞（北京金紫晶公司）进行复苏，然后将复苏后的细胞放在DMEM培养液（Gibco公司）中，培养液含有10％胎牛血清（Hyclone公司）、100u／mL青霉素和100pg／mL链霉素。将培养液放在培养箱中进行培养，培养箱的温度为37℃且相对饱和湿度，CO2体积分数为5％。取处于对数生长期的细胞进行下述实验。

1．2小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立及分组处理雄性健康清洁级C57BL/6小鼠18只（中国医科大学实验动物中心），6-8周，体重（20±2）g。首先取三只C57BL/6小鼠，在每只C57BL/6小鼠右前肢腋下皮下注射Lewis肺癌细胞悬液0.5ml（细胞悬液密度至2×107个细胞／mL）。两周后3只小鼠右前肢腋下均形成皮下瘤，将3只小鼠脱颈椎处死，将瘤组织无菌取出，然后用生理盐水进行研磨，离心，制成细胞悬液。在余下15只小鼠右前肢腋下皮下注射0.2ml细胞悬液（细胞数约5.0*106），一周后开始治疗。将小鼠随机分成3组，每组5只C57BL/6小鼠。3组分别为PBS对照组，每隔一天予小鼠腹腔注射PBS；对照siRNA组，每隔一天予小鼠腹腔注射无关对照siRNA，终浓度为100nmol／L；p65siRNA组，每隔一天予小鼠腹腔注射p65siRNA，终浓度为100nmol／L.2周后，将小鼠脱颈椎处死，取出瘤组织进行检测。p65siRNA序列为5'-GATCAATGGCTACACAGGA-3'（SantaCruz，CA，USA），无关对照siRNA序列是5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SantaCruz，CA，USA）.

1．3荧光定量-PCR法分析Bcl-2和BaxmRNA表达水平

将新鲜肿瘤组织迅速置于液氮中冷冻保存。使用Trizol法提取各组移植瘤组织总ＲNA，每例提取2μL，DNaseI消化去除ＲNA中的DNA，经测定OD值，OD260/OD280的比值1．8～2．0，同时扩增GAPDH作为参照，每个标本重复3遍，反转录合成cDNA用于PCR反应。首先将引物稀释至10μM（或根据引物不同情况稀释）.将装有cDNA模板，上下游引物，SYBRGREENmastermix的反应管置入荧光定量PCR扩增仪中扩增：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。观察样品溶解曲线锋形是否单一，确认反应特异性，记录每个样品Cp值，用于mＲNA相对表达量分析。本实验利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM96荧光定量仪进行荧光定量分析.

1．4Westernblot检测Bcl-2和Bax蛋白表达蛋白样品经SDS-PAGE电泳并PVDF膜转膜，5%BSA封闭2h，PBST洗膜3次，每次10min。加一抗，４℃过夜。洗膜后加入稀释的二抗，室温反应1h，经暗室曝光。目的蛋白的相对表达量用GeneTools软件进行分析。

1．5统计学方法采用SPSS13．0软件进行统计学分析。各实验均重复3次，结果计量数据用表示，多个样本间均数比较采用单因数方差分析。以P<0．05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1NF-κBsiRNA对小鼠移植瘤中Bcl-2和Bax表达的影响

2．1．1Bcl-2和BaxmRNA表达水平的变化荧光定量-PCR分析结果显示，与PBS对照组及对照siRNA组相比，p65siRNA组中Bcl-2mRNA的表达水平明显下降，差异具有统计学意义（P<0．05，图2G-H）.而BaxmRNA的表达水平明显上升，差异具有统计学意义（P<0．05，图1I）.

2.1.2Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化Westernblot检测结果显示，与PBS对照组和对照siRNA组相比，p65siRNA组中Bcl-2蛋白的表达均明显下降，差异具有统计学意义（P<0．05，图1A、1B、1D、1E），而Bax蛋白的表达水平明显上升，差异具有统计学意义（P<0．05，图1C、1F）.

3讨论

随着肺癌发病率和死亡率的不断提高，人们迫切需要更有效的方法来防治肺癌，siRNA技术是一种行之有效的通过调节转录后的mRNA的翻译而使基因沉抑的一种技术[11]，目前RNA小干扰经常被用于体内或体外来抑制基因的表达来评估靶基因的作用或评价基因沉默的治疗效果。NF-κB是一个很关键的转录因子，它是很重要的抗凋亡蛋白，与肿瘤细胞的增殖密切相关[14-16]。已报道NF-κB在其他多种肿瘤中拥有很强的抗凋亡作用[17]，之前我们已用TUNEL检测法检测移植瘤细胞凋亡情况[18]，并且发现p65siRNA明显诱导肿瘤细胞凋亡，我们目前的研究表明阻断NF-κBp65的表达可以显著地上调Bax的表达，明显降低Bcl-2的表达。Bcl-2基因是一种抑凋亡基因，多位于细胞内的内质网膜和线粒体及核膜上。Bax是一种处凋亡基因，大多位于线粒体膜上和细胞浆内，属于能溶于水的蛋白质。一般情况下，Bax和Bcl－2是以异源二聚体的形式存在的，这个时候细胞一般不发生凋亡，如受相关凋亡信号的刺激，Bax数量上升时，Bax即由细胞质移至线粒体膜上构成同源二聚体，改变线粒体的通透性以及损伤氧化磷酸化，释放细胞色素C和其他凋亡相关蛋白，使Caspase3进一步被激活从而诱导细胞的凋亡[19-21]。之前的研究已证实Bax和Bcl-2在凋亡中起重要作用。

我们对p65siRNA诱导Bcl-2和Bax表达的研究，进一步证实了Bcl-2和Bax在肺癌凋亡中的作用。今后，我们还将进一步研究其他凋亡因子及其他因素在肺癌生长中的作用。

参考文献：

[1]A.Jemal.F.Bray，M.M.Centeretal.GlobalCancerStatistics[J].CA-ACANCERJOURNALFORCLINICLANS，2011，61（2）：69-90

[2]SHAPIROM：Theroleofadjuvantchemotherapyinearly-stageandlocallyadvancednon-smallcelllungcancer.ClevelandClinicJournalofMedicine79：e-S42-e-S45，2012.

[3]ChenY-T，FengBandChenL-B：Updateofresearchondrugresistanceinsmallcelllungcancerchemotherapy.AsianPac.J.CancerPrev13：3577-3581，2012.