肿瘤相关抗原MAGE-A1,A2,A3,A4在原发性肝癌组织中表达的研究

肿瘤相关抗原MAGE-A1,A2,A3,A4在原发性肝癌组织中表达的研究

游泳孙巍石刚朱兴宋铎

游泳孙巍石刚朱兴宋铎

（沈阳市第四人民医院肝胆外科辽宁沈阳110031）

【摘要】目的研究黑色素瘤抗原MAGE-A1,A2,A3,A4基因在原发性肝癌(HCC)组织中的表达，探讨MAGE-A1,A2,A3,A4基因与HCC患者临床指标的关系。方法RT-PCR方法检测30例HCC患者癌组织及相应癌旁组织MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达。结果30例HCC患者癌组织中MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率分别为40%，13%，47%和17%显著高于癌旁组织(0)(P<0.01)。统计学分析显示HCC患者癌组织中MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率与患者性别、年龄、有无包膜以及乙型肝炎病毒感染等指标均无关(P>0.05)；MAGE-A1和MAGE-A3的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性(P<0.05)。结论MAGE-A1,A3在HCC中特异性高表达，可以用于HCC的免疫治疗。

【关键词】肝癌黑色素瘤抗原基因逆转录聚合酶链反应

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）16-0221-02

黑色素瘤抗原(MAGE)基因编码肿瘤相关抗原，可被自身特异性杀伤性T淋巴细胞识别，应用MAGE基因的这一特性制备抗原肽疫苗，用于多种恶性肿瘤的预防和治疗[1,2]。我们应用RT-PCR法对MAGE-A1，A2，A3，A4基因在HCC中的表达进行检测，为利用MAGE基因对HCC患者免疫治疗提供理论依据。

材料与方法

1材料

1.1组织标本对象选取2011年1月-2013年6月沈阳市第四人民医院肝胆外科收治的HCC患者30例，伴有乙型肝炎病毒阳性26例。其中男女比例为2:3，年龄38-72岁，平均56.3岁。全部患者均行手术完整切除病灶，并经术后病理证实，切缘均阴性。病灶切除后，先距肿瘤边缘3cm以外切取癌旁组织，再取癌组织，分别切成直径约1cm的小块，-80℃冻存备用。另取正常的睾丸组织(沈阳市第四人民医院病理科)作为阳性对照。

1.2引物根据Genbank数据库中所查MAGE-A1，A2，A3，A4基因序列，使用Omiga2软件设计引物(表1)。

表1MAGE-A1，A2，A3，A4基因mRNART-PCR引物

注:F表示上游引物，R表示下游引物

1.3试剂Trizol试剂购自美国Gibco公司，脱氧核苷酸（dNTPs)购自Pharmacia公司,RNA逆转录酶(MMLV)和TaqDNA聚合酶购自Promega公司。

2方法

2.1总RNA提取取100mg在-80℃保存的组织，于液氮中研成碎末后，迅速加入Trizol试剂1ml裂解，经三氯甲烷分层、异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤干燥后，将所得RNA溶于无RNA酶的纯水中，采用紫外分光光度计(Beckman公司.1DU640)对其定量后再分别进行cDNA合成和RNA电泳。

2.2cDNA合成稀释RNA至lμg/μL,逆转录合成cDNA(25μL反应体系):按试剂盒操作说明进行,37℃反应1.5h，94℃灭活6min，得到cDNA。

2.3RT-PCR2μLcDNA在各自引物引导下分别PCR扩增(25μL反应体系):加17μL双蒸水、2.5μL10×buffer、1.5μLMgCL2、1μLdNTPs、lμL引物、0.1μLTaq酶。循环参数为94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环后72℃延伸5min。MAGE-A3退火用54℃,MAGE-A1，A2,A4均为63℃。每次反应都用β-actin作阳性内参照，用正常睾丸做阳性外参照。5μLPCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Kodak凝胶图像分析系统摄图片。

2.4肝炎病毒、AFP检测本实验采用ELISA方法检测乙肝病毒表面抗原、AFP水平。

2.5统计学方法使用SPSS10.0软件建立数据库,χ2检验和四格表确切概率法，设P<0.05表示其差异具有统计学意义。

结果

1.1MAGE基因在HCC中的表达情况

RT-PCR电泳显示：所有内参照均为阳性。阳性对照的MAGE带显示良好.而空白对照均无任何背景。癌旁组织中均未检测到MAGE-A1,A2,A3,A4的表达。MAGE-A1A2,A3,A4扩增产物见图1。30例HCC患者癌组织中MAGE-A1基因表达的阳性率为40%（12/30），MAGE-A2基因表达的阳性率为13%(4/30)，MAGE-A3基因表达的阳性率为47%(14/30),MAGE-A4基因表达的阳性率为17%(5/30)均显著高于癌旁组织(0)(P<0.01)。

1.Marker；2、3、4、5：β-actin6.MAGE-A1；7.MAGE-A2；8.MAGE-A3；9.MAGE-A4

1.2MAGE基因表达与临床有关指标的关系

30例所检测的HCC中，MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达与临床有关指标的关系见表2。

表2MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达与各临床指标的关系

讨论

人们对MAGE基因家族的研究时间很短,但是它潜在的抗癌免疫治疗及肿瘤监测和预后判断的临床应用己经被人们所认识。

本研究显示，30例HCC患者癌组织中MAGE-A1，A2，A3，A4基因均有较高表达，70%至少表达1种MAGE基因。对比临床资料发现MAGE-A1，A2，A3，A4基因与患者的年龄、性别、病毒感染、有无完整包膜等均无关，而MAGE-A1，A3的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性，提示检测血清中MAGE-A1，A3基因编码蛋白特异性抗体的表达.可能作为HCC的辅助诊断指标之一，尤其是AFP阴性及大肝癌的HCC患者中有可能作为肿瘤标志物，用于肿瘤的辅助诊断和作为监测复发、转移的指标之一。

对比国外的相关研究资料[3]其MAGE-A1，A2，A3，A4基因表达率均明显高于本研究，这些差异不排除与病人选择的地区差异及国外报道的病例大多数为丙型肝炎病毒阳性有关。

综上，MAGE-A1，MAGE-A3基因在HCC患者癌组织中的特异表达.提示可以以MAGE-A1，A3基因编码抗原作为HCC免疫治疗的攻击靶点,为HCC患者的诊断和治疗提供帮助。

参考文献

[1]MarchanDM,PuntCJ,AamdalS,etal.ImmunizationofmetastaticcancerpatientswithMAGE-3proteincombinedwithadjuvantSBAS-2aclinicalreport[J].EurJGancer2003.39(1):70-77.

[2]JagerE,JagerD,KnuthA.Clinicalcancervaccinetrials[J].CurrOpinImmunol2002,14(2):178-182.

[3]TaharaK,MoriM,SadanagaN,etal.ExpressionoftheMAGEgenefamilyinhumanhepatocellularcarcinoma[J].Cancer,1999,85(6);1234-1240.

沈阳市社会发展领域科技计划项目：项目名称：黑色素瘤抗原MAGE-A1,A2,A3,A4在原发性肝癌组织中表达的研究项目编号：122331