APJ拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化小鼠肝脏TGF-β1表达的影响

APJ拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化小鼠肝脏TGF-β1表达的影响

肖四海龙海燕谭华清(通讯作者)

肖四海龙海燕谭华清(通讯作者)

（南华大学附属娄底医院<娄底市中心医院>湖南娄底417000）

【摘要】目的:观察血管紧张素受体ATI相关的受体蛋白（APJ）拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝功能的保护作用及其作用机制。方法:30只雄性SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化模型组和Apelin13(F13A)（75μg/kg）处理组。采用四氯化碳（CCl4）诱导大鼠肝纤维化模型。Apelin13(F13A)通过皮下注射给药。检测肝功能和血清转化生长因子-β1（TGF-β1）水平。采用实时定量PCR和Westernblot检测肝脏中TGF-β1的表达。结果:与模型组比较，Apelin13(F13A)处理显著降低了大鼠血清ALT、AST和TGF-β1的水平，增加了血清ALB水平，降低了大鼠肝脏组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达。结论:APJ拮抗剂Apelin13(F13A)保护了肝纤维化大鼠的肝功能，其机制可能与Apelin13(F13A)降低TGF-β1的表达有关。

【关键词】Apelin肝纤维化肝功能

【中图分类号】R575【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）23-0082-03

肝纤维化是很多慢性肝病的共同病理生理学基础，也是肝硬化发生发展过程中的一个必经阶段。肝纤维化主要是细胞外基质蛋白包括胶原等降解相对不足，过度沉积引起的。转化生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1）是导致细胞外基质沉积，启动和形成肝纤维化重要的刺激因子[1]。Apelin由Tatemoto等从牛胃的分泌物中分离并提取出的G蛋白耦联受体血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白（putativereceptorproteinrelatedtotheangiotensinreceptorATl，APJ）的天然配体。研究发现血浆中Apelin的水平是肝纤维化进展的标志物，Apelin/APJ系统参与肝脏疾病的发生，Apelin/APJ系统的激活促进肝纤维化的发展[2]。而APJ的阻断是否能抑制肝纤维化和保护肝功能及机制，目前还不清楚。因此本研究拟观察APJ拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝功能的保护作用，并从TGF-β1角度探讨Apelin13(F13A)保护肝纤维化大鼠肝功能的可能机制。

1材料和方法

1.1材料

APJ拮抗剂Apelin13(F13A)为美国Sigma公司产品。四氯化碳CCl4购自汕头西陇化工厂，临用前用石蜡油1:1稀释。谷丙转氨酶（alaninetransaminase,ALT），谷草转氨酶（aspartatetransaminase,AST）和白蛋白（albumin,ALB）检测试剂盒为南京建成生物工程公司产品。TGF-β1ELISA法检测试剂盒为上海森雄科技实业有限公司产品。

1.2实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠30只，6周龄，体质量200-220g，由南华大学实验动物学部提供。

1.3实验方法

1.3.1实验分组和动物模型制备

30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为正常组、模型组和Apelin13(F13A)处理组。模型组和Apelin13(F13A)处理组给予40%CCl4的石蜡油（0.1mL/kg）腹腔注射，每周2次，共进行8周；对照组腹腔注射石蜡油（0.1mL/kg）。将Apelin13(F13A)溶解于生理盐水，Apelin-13处理组大鼠在进行CCl4腹腔注射的当天给予Apelin13(F13A)（0.1mg/kg）腹腔注射，其他则给予等量生理盐水腹腔注射，每2天1次，共进行8周。

1.3.2肝功能和血清TGF-β水平的检测

实验进行到第8周末，将大鼠麻醉后，处死大鼠，心脏放血，分离血清，用全自动生化检测仪检测血清ALT，AST和白蛋白(ALB)水平，按试剂盒说明进行操作。采用ELIsA法检测血清TGF-β1的水平。

1.3.3实时定量PCR

实验进行到第8周末，将大鼠麻醉后，心脏放血处死大鼠，迅速取出大鼠肝脏，取适量肝脏组织制备组织匀浆。按说明书应用TTrizol提取总RNA。进行逆转录反应，合成cDNA第一链。取cDNA样品梯度稀释，进行实时定量PCR反应。TGF-β1上游引物序列：5′-CTCGGAGTCAGAGTACTATGC-3′，下游引物序列：5′-AGCCACTCGCGCACAGTGTCA-3′；β-actin引物：上游：5′-CGATCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTTGCAGTGTGCTATACTCG-3′。反应体系包含4μLcDNA，上下游引物各1μL，1μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），1μL双链DNA特异性结合的荧光染料（SYBRGreen0NE）（50×）和8μLdNTPMix（2×），总反应体系为30μL。反应条件为：94℃，30s；60℃，50s；72℃，60s，共进行40个循环。采用2-△△CT法对数据分析处理，以对照组为100%，对目的基因的TGF-β1mRNA表达进行分析。

1.3.4Westernblotting

实验进行到第8周末，将大鼠麻醉后，心脏放血处死大鼠，迅速取出大鼠肝脏，提取肝脏组织总蛋白,BAC法测定蛋白浓度。取100μL样本加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中，煮沸。然后凝胶电泳1h分离蛋白，将分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脱脂牛奶封闭2h，加入兔抗鼠TGF-β1和β-actin一抗，4℃下过夜。加入羊抗兔二抗，室温下孵育6h。显影后进行半定量分析。

1.4统计学处理

数据均以±SD表示。用SPSS19.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析进行统计分析，组间差异的两两比较采用LSD-t检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝功能的影响

结果如表1所示：与对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清ALT和AST水平均显著增加，ALB水平显著降低（均P﹤0.05），说明造模成功；与模型组比较，Apelin13(F13A)处理显著降低了大鼠血清ALT和AST水平，增加了血清ALB水平（均P﹤0.05）。

表1Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝功能的影响

组别ALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)

对照组28.46±1.9679.34±5.448.52±4.15

模型组246.12±18.42*354.16±32.56*12.04±1.24*

Apelin13(F13A)组86.29±6.81#116.21±9.03#33.65±4.08#

*P﹤0.05，与对照组比较；#P﹤0.05，与模型组比较。

2.2Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠血清TGF-β1水平的影响

结果如图1所示：与对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清TGF-β1水平均显著增加（P﹤0.05）；与模型组比较，Apelin13(F13A)处理显著降低了大鼠血清TGF-β1水平(P﹤0.05）。

图1Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠血清TGF-β1水平的影响

*P﹤0.05，与对照组比较；#P﹤0.05，与模型组比较。

2.3Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1表达的影响

结果如图2所示：与对照组比较，肝纤维化模型组大鼠肝脏组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达显著增加（P﹤0.05）；与模型组比较，Apelin13(F13A)处理显著降低了大鼠肝脏组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达（P﹤0.05）。

图2Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏组织TGF-β1表达的影响

*P﹤0.05，与对照组比较；#P﹤0.05，与模型组比较。

3讨论

肝纤维化是指由各种致病原因所引起的肝内结缔组织的异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝脏疾病的病理学改变。肝纤维化是肝硬化形成过程中必经的阶段，在肝纤维化发生发展过程中肝星状细胞活化是肝纤维化发生的核心环节。活化的肝星状细胞可分泌TGF-β1，TGF-β1属于二聚多肽类的生长因子家族，是一类具有多种活性的细胞因子，也是最强的促纤维合成的因子。

TGF-β1可使静息状态下的肝星状细胞活化或转化为成纤维细胞，并能刺激这些细胞向损伤部位迁移和增殖，同时活化的肝星状细胞能自分泌TGF-β1。在肝纤维化的发生发展过程中，TGF-β1一方面能促进ECM合成，抑制ECM降解，导致ECM在肝脏的沉积，从而使肝实质受损和肝脏功能的损伤；另一方面，肝实质受损后也可以释放TGF-β1，释放的TGF-β1是启动静息状态肝星状细胞激活和转化的主要信号之一，使肝星状细胞转化为成纤维细胞，成纤维细胞再通过旁分泌和自分泌作用促进大量以胶原为主的ECM合成，从而形成正反馈效应，导致胶原的大量合成，促进肝纤维化的持续发展。因此肝星状细胞的活化是肝纤维化形成的中心环节，活化的肝星状细胞产生的TGF-β1是肝纤维化形成的关键环节，因而降低TGF-β1的水平，促进沉积胶原的降解，是逆转肝纤维化以及肝硬化的重要途径。研究发现肝脏过表达TGF-β1的转基因小鼠明显加快肝纤维化的进展，运用TGF-β1的反义寡核苷酸降低TGF-β1的表达能显著抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化的形成。

Apelin是一种小分子内源性神经肽，是APJ的天然配体。Apelin/APJ系统均在肝脏中表达，与许多肝脏疾病的发生发展密切相关。Apelin前体肽在蛋白水解酶的作用下可分解为长度不同的多肽片段，主要有Apelin-12、Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等片段。不同长度的Apelin多肽片段在体内的分布以及和APJ的结合力都不相同，其生理与药理作用也不相同，其中Apelin-13在肝脏中的表达较高。研究显示肝脏间质的星状细胞可表达Apelin，而其受体APJ则主要在肝实质细胞表达。正常情况下，两者在肝脏中的表达均比较低，而在肝硬化大鼠中Apelin在肝星状细胞表达明显增加，是正常水平的4倍，而在肺、心脏、肾脏中的表达却没有增加；APJ的表达增加更明显，是对照组的300倍；而给予APJ拮抗剂Apelin13(F13A)后，肝纤维化程度减轻，血管生成减少，心、肾功能得到改善[2]。这些结果提示Apelin/APJ系统可能参与了肝纤维化形成的过程，在肝纤维化中Apelin/APJ系统是过度激活的，对肝脏产生了有害的效应，而其拮抗系统却可抑制肝纤维化的形成，但是其机制还不清楚。Apelin13(F13A)是Apelin-13的类似物，是Apelin-13多肽C末端的苯丙氨酸残基被丙氨酸残基所取代导致。虽然Apelin13(F13A)能与APJ结合，但是不能激活APJ，而成为APJ的阻断剂。

本研究中，我们的结果显示：与模型组比较，APJ拮抗剂Apelin13(F13A)处理显著降低了大鼠血清ALT、AST的水平，增加了血清ALB水平，这与文献报道的结果一致，这些结果提示Apelin13(F13A)可以改善肝纤维化大鼠的肝功能，Apelin/APJ系统可成为肝纤维化的防治靶点；Apelin13(F13A)降低了血清中TGF-β1的水平同时也降低了大鼠肝脏组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达。这些结果提示Apelin13(F13A)可以改善肝纤维化大鼠的肝功能可能与降低TGF-β1的水平有关。

总之，我们的研究结果阐明APJ拮抗剂Apelin13(F13A)保护了肝纤维化大鼠的肝功能，其机制可能与Apelin13(F13A)降低TGF-β1的表达有关，我们的研究为肝纤维化的防治提供了新的策略和思路。

参考文献

[1]陈小亮,李俊,邓子煜,等.苦参素对肝纤维化大鼠肝脏TGF-β1的调节作用[J].中国药理学通报,2009：25(6)：761-764.

[2]詹莉琼,郑伟强.Apelin-APJ系统与肝脏疾病的研究进展[J].广东医学院学报,2011,29（6）：678-681.