探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用

探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用

吴向华

黑龙江省传染病防治院150518

【摘要】目的：研究分析从人血清提取ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被进行抗原检测，并讨论结核病诊断新方法。方法：利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68，建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接ELISA检测方法，并与PPD-ELISA同时检测220例结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清，分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果：ESAT6-ELISA的敏感性为25%，特异性为95%；CFP10-ESAT6-ELISA的敏感性为45%，特异性为93%；ESAT6-PPE68-ELISA的敏感性为48%，特异性为85%。结论：三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于PPD-ELISA，但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于PPD-ELISA，其中CFP10-ESAT6-ELISA检测的效果最佳，PPE68可作为结核特异性诊断的候选抗原。

【关键词】结核分枝杆菌；ESAT6；CFP10；PPE68；ELISA

结核病作为一种慢性传染性疾病，近年来发病率有上升趋势，临床上认为结核分枝杆菌引发呼吸道慢性传染是结核病发病的根源，由于其较高的感染率与耐药性，因此结核病的快速诊断对于结核防治有着重要的作用，但至今尚没有一种准确、快速、可靠的检测结核分枝杆菌感染的方法。结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的复杂蛋白物质，含有多种抗原成分，其最大的弱点是PPD所包含的抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（bacilluscalmetteguerin，BCG）所共有[1]，故阳性结果也不能区分是致病性分枝杆菌还是非致病性分枝杆菌感，染抑或是接种BCG免疫的结果，大大减低了检测的特异性。因此本实验以PPD为参考，在建立PPD-ELISA的基础上，以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为抗原，并对三种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断效果进行了比较和评估。

1材料与方法

1.1抗原与主要试剂

纯化重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68由本室前期制备，结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）由贵阳市疾病预防控制中心提供。

主要试剂：牛血清白蛋白（BSA）由上海生工公司提供；脱脂乳（MILK）为雀巢公司产品；HRP标记的羊抗人IgG及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；96孔酶标板为德国Greiner公司产品；ELISA相关溶液由实验室自己配制。

1.2结核病参考血清和临床待检血清

结核病参考血清和临床待检血清由贵阳疾病预防控制中心提供。临床待检血清中220例为痰涂片染色镜检阳性、临床及X线诊断为肺结核的结核病人血清，其中男148例，女72例，年龄14～78岁。30例非结核呼吸疾病病人（肺炎、急慢性支气管炎、肺癌）血清由我院呼吸科提供。

1.3方法

1.3.1PPD-ELISA最佳反应条件的确立

抗原PPD按1∶400包被，即42μg/ml，放置4℃过夜，取出洗涤5次，每次5min后，每孔加入200μl1.0%BSA封闭液，37℃封闭1h。血清样本用PBST按1∶40稀释，100μl/孔，37℃反应1h后，洗涤5次。加入1∶2000稀释的HRP标记的羊抗人IgG100μl/孔，37℃反应30min，洗涤5次，最后拍干，每孔加入DAB底物液100μl，室温避光反应10min，最后加入50μl2mol/LH2SO4终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定吸光度A值。PPD-ELISA阴阳界限的确定：PPD-ELISA检测80份健康人群血清，计算样品/阴性（S/N）平均值为1.55，SD为0.32，求得临界S/N=X+2SD=2.19，临界吸光度A值为N×2.19，当N<0.05时以0.05计算。

1.3.2结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测方法的建立

分别以结核分枝杆菌特异性蛋白抗原ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68作为包被用抗原，参照确立的PPD-ELISA方法，方阵滴定确定特异抗原ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68的抗原包被液均按照1∶200稀释，浓度分别为8μg/ml、9μg/ml和10μg/ml，血清稀释度为1∶40。建立三种间接ELISA检测方法，检测病人血清中的结核分枝杆菌特异性抗体，分别命名为ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68。参照PPD-ELISA临界值的确定方法，计算各ELISA的临界值。

1.3.3结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测方法的统计学分析

用PPD-ELISA和建立的检测特异性抗体的间接ELISA检测方法分别检测220例确诊的结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清，统计各种方法的灵敏度与特异性，对几种检测方法进行分析和评价。

2结果

2.1结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测方法的评价

2.1.1结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测方法的敏感性与特异性比较

分别采用PPD、ESAT6、CFP10-ESAT6以及ESAT6-PPE68检测220例确诊的结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清，统计四种方法的敏感性与特异性，。以上结果表明，三种结核分枝杆菌特异性抗体的敏感性较低，但特异性均高于PPD-ELISA法。经统计，CFP10-ESAT6的敏感性高于ESAT6但CFP10-ESAT6与ESAT6-PPE68比较两种方法的敏感性差异无统计学意义。CFP10-ESAT6的特异性高于ESAT6-PPE68。

2.1.1结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测与PPD-ELISA检测的比较

结果三种特异性抗体ELISA检测方法与PPD-ELISA的符合率分别为62%、80%和80%，相对敏感性分别为38%、72%和75%。PPD-ELISA检测的95名阴性病人中结核特异抗体ELISA检测方法分别检出7名、9名和12名阳性病人。经统计，三种结核特异性抗体ELISA检测方法的敏感性均不如PPD-ELISA检测方法，但特异性均高于PPD-ELISA检测方法。

3讨论

本实验以结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法[2]。通过与PPD-ELISA进行比较发现，三种特异性抗体ELISA检测方法对结核病的诊断显示出了更高的特异性，将特异性抗体ELISA检测方法用于复检PPD-ELISA阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较三种特异性抗体ELISA检测方法的特异性与灵敏度，发现两融合蛋白-ELISA的敏感性高于单一蛋白ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISA之间的敏感性无差异，但CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于ESAT6-PPE68-ELISA，三种特异性抗体ELISA检测方法中CFP10-ESAT6-ELISA的效果最好，PPE68也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。

PPE68是由位于结核分枝杆菌基因组RD1区的Rv3873所编码的蛋白，属于一组富含甘氨酸的独特的蛋白质家族-PPE蛋白家族[3]。对PPE68的免疫原性研究表明，PPE68蛋白可以产生迟发性超敏反应，能够激出强烈的细胞免疫，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导大量IFN-γ的产生[4，5]。Demangel等[8]的研究表明，该蛋白主要存在于结核分枝杆菌菌壁中，具有很高的特异性。本实验建立的结核特异性抗体ESAT6-PPE68-ELISA检测方法的敏感性比CFP10-ESAT6-ELISA略高，但差异不具有统计学意义，其特异性低于ESAT6-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA，但高于PPD-ELISA的特异性，差异具有统计学意义，认为PPE68蛋白可以作为一种较好的结核病特异性诊断用候选抗原。

虽然PPD-ELISA的敏感性高于三种结核特异性抗体ELISA方法，但存在特异性较低的弱点，实验发现结核特异性抗体ELISA检测方法能从PPD-ELISA检测阴性的病人中检出阳性。由于PPD在特异性上存在的问题以及单一特异抗原蛋白用于检测的敏感性低，将多种特异性高的抗原蛋白联合应用于检测结核病患者血清中的特异性抗体是结核病血清学诊断试剂的研究方向，积极寻找特异性高的结核诊断候选抗原将有助于结核病的防治[6]。

参考文献：

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