盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查方法学研究

盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查方法学研究

权晓丹刘丽英

权晓丹刘丽英

(黑龙江三元阳普医药有限公司)

【摘要】目的：建立盐酸法舒地尔注射液细菌内毒素检查的方法学研究。方法：参照2010年版《中国药典(二部)》细菌内毒素检查法进行试验。结果：样品经稀释后对内毒素检查无干扰，将细菌内毒素限值定为0.5EU/ml，可以选择灵敏度0.25Eu/ml的鲎试剂进行内毒素检查。结论：样品在最大稀释倍数内对内毒素检查无干扰。

【关键词】盐酸法舒地尔注射液；细菌内毒素检查法干扰试验

盐酸法舒地尔是一种蛋白激酶抑制剂即细胞内钙离子拮抗剂。改善及预防蛛网膜下腔出血术后的脑血管痉挛及随之引起的脑缺血症状。

国际医学专家在病理研究中发现，抑制患者组织内的Rho激酶异常活跃是治疗心脑血管疾病的关键，成为国际上的研究热点，盐酸法舒地尔注射液是国际上唯一一个已经上市的Rho激酶抑制剂，由日本旭化成制药株式会社研制成功，1995年6月在日本上市，商品名为“依立卢”，规格2ml:30mg。

盐酸法舒地尔注射液在我国研究起步于1997年，天津市药物研究院和天津红日药业公司合作研究，并获得国家科技部科技型企业创新基金支持，于2004年获得了国家二类新药证书，商品名“川威”。目前国内标准[1]采用家兔法进行热原检查，由于细菌内毒素检查法具有灵敏、快速、操作简便、结果准确等优点。因此我们参考《中国药典(二部)》细菌内毒素检查法[2]，对盐酸法舒地尔注射液进行细菌内毒素检查的可行性进行研究，报道如下。

1.实验材料及仪器

鲎试剂：湛江安度斯生物有限公司生产，批号：1010112(灵敏度0.25EU/ml，规格0.1ml)、批号：1008202(灵敏度0.125EU/ml，规格0.1ml)。

细菌内毒素检查用水：湛江安度斯生物有限公司生产，批号1005240，规格5ml。细菌内毒素工作标准品：批号201070，效价120EU/支，中国药品生物制品检定所生产。

旋涡混合器：XW-80A型，厂家：上海医大仪器厂。电热恒温水浴锅：DK-98-Z型，厂家：天津泰斯特仪器有限公司。

2.试验方法和结果

2.1灵敏度复核试验将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，轻摇，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的细菌内毒素工作标准品系列溶液(每次稀释在旋涡混合器上混合30s)。用细菌内毒素检查用水将内毒素稀释具体过程如下：

120EU+1ml水—→120EU/ml—→2EU/ml—→1.0EU/ml(4λ)—→0.5EU/ml—→0.25EU/ml—→0.125EU/ml—→0.0625EU/ml每一浓度平行做4管，每管加入内毒素标准溶液0.1ml(同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管)，轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入(37±1)℃恒温水浴箱中，保温(60±2)min后观察。

结果：根据公式λc=lg-1(ΣX/4)，计算出λc=0.210EU/ml，λc在0.5λ～2.0λ范围内。因此该批号的鲎试剂灵敏度符合要求。根据公式λc=lg-1(ΣX/4)，计算出λc=0.105EU/ml。λc在0.5λ～2.0λ范围内。

以上实验说明，批号：1010112(规格0.1ml，灵敏度0.25EU/ml)、批号：1008202(规格0.1ml，灵敏度0.125EU/ml)的鲎试剂灵敏度符合要求，可以进行下步试验。

2.2限度的确定

采用公式L＝K/M(M：以成人每公斤体重每小时给药的最大剂量来计算)，本品为注射剂，根据用法用量，成人一日2～3次，每次30mg，以50～100ml的生理盐水或葡萄糖注射液稀释后静脉滴注，每次静滴时间约为30分钟，注射时间不足1小时，按1小时计算。

按最大静滴量100ml/小时计算，中国人平均体重60kg计算，则M＝100&pide;60&pide;1=1.67ml/kg/h，故本品的细菌内毒素的理论限值：L＝5&pide;1.67=3Eu/ml。为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格控制本品内毒素，规定本品的细菌内毒素的限值L定为：0.5Eu/ml。

2.3预干扰试验

2.3.1供试品溶液的制备

以鲎试剂灵敏度0.125Eu/ml为基准，按MVD＝LC/λ＝0.5/0.125＝4倍(C按1.0ml/ml计算)，当灵敏度为λ=0.25EU/ml时，供试品溶液的最大稀释倍数为：2倍。供试品溶液15mg/ml—→7.5mg/ml

2.3.2内毒素溶液的稀释浓度

用细菌内毒素检查用水将内毒素稀释具体过程如下：120EU+1ml水—→120EU/ml—→2.0EU/ml—→1.0EU/ml—→0.5EU/ml—→0.25EU/ml

2.3.3含供试品及内毒素混合溶液的制备

鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml：取供试品溶液0.1ml与1.0EU/ml内毒素溶液0.1ml以1:1比例混合；依此方法依次制成供试品稀释倍数为1、2、4、8分别与1.0EU/ml内毒素1:1的混合溶液作为供试品阳性对照溶液。

鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml：取供试品溶液0.1ml与0.5EU/ml内毒素溶液0.1ml以1:1比例混合；依此方法依次制成供试品稀释倍数为1、2、4、8分别与0.5EU/ml内毒素1:1的混合溶液作为供试品阳性对照溶液。

2.4样品测定

根据上述确定的稀释浓度，分别取供试品阳性对照溶液、供试品溶液、同时分别以细菌内毒素浓度0.5EU/ml和0.25EU/ml为阳性对照，检查用水做阴性对照。每一个样品平行做两管，分别向上述测试溶液中加入两个不同灵敏度的鲎试剂，轻轻混匀，37℃±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。

结果：依据以上实验结果，在样品稀释倍数为１倍时供试品阳性均为阳性，在稀释倍数为4倍(MVD)处也出现全阳性结果，表明此样品对鲎试剂无干扰，在有效稀释倍数范围内，可以选择灵敏度高于0.5Eu/ml的鲎试剂对相应的样品稀释倍数做干扰试验。

2.5干扰试验按中国药典2010年版二部附录XIE-细菌内毒素检查法进行干扰试验。选λ=0.125EU/ml和λ=0.25EU/ml鲎试剂。将细菌内毒素工作标准品分别用细菌内毒素检查用水稀释至4λ、2λ、1λ、0.5λ内毒素标准对照溶液(Es)。分取细菌内毒素系列浓度分别与供试品溶液(稀释倍数分别为4倍、2倍)按1:1的比例混合制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液(Et)，并同时进行阴性对照及阳性对照，37℃±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。

供试品稀释过程：1支供试品(2ml:30mg)—→15mg/ml—→7.5mg/ml内毒素溶液的稀释浓度：120EU+1ml水—→120EU/ml—→2.0EU/ml—→1.0EU/ml—→0.5EU/ml—→0.25EU/ml—→0.125EU/ml

结果：ES在0.5λ-2λ范围内，且Et也在0.5ES-2λES之间，说明供试品稀释2倍、4倍对检测均没有干扰。

3.结论：

样品在最大稀释倍数内对内毒素检查无干扰，将细菌内毒素限值定为0.5EU/ml，可以选择灵敏度高于0.5Eu/ml的鲎试剂进行内毒素检查。

参考文献

[1]盐酸法舒地尔国家药品标准.WS1-(X-110)-2006Z

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版二部.北京：化学工业出版社，附录99.