手工密闭式制备冰冻解冻去甘油红细胞的方法探讨

手工密闭式制备冰冻解冻去甘油红细胞的方法探讨

杨宇珠王进喜张云荷

（大理州中心血站云南大理671000）

【中图分类号】R197.61【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）30-0397-01

冰冻红细胞主要用于RH（D）阴性稀有血型和自身输血人群等。在中国，汉族和其它少数民族，Rh阴型血的人约占0.34%。而临床手术患者中出现RH（D）阴性的几率是5～7/1000。相比之下，Rh阴性血型的血液就十分珍贵。随着大理州输血事业的发展，临床用血也不断增加，原有的RH（D）阴性献血员团队已不能满足临床用血，特别是急诊用血。我站为缓解特殊人群急诊用血，开展了“冰冻解冻去甘油红细胞”手工制备的新技术。

1.材料与方法

1.1血液来源

经检验，确认为RH（D）阴性，且各项指标合格的采集保存于4℃冰箱6天内的红细胞悬液。

1.2设备及材料

红细胞悬液、久保田9942大型低温高速离心机及配套的离心杯、微电脑采液控制器、无菌接管机（泰尔茂）、高频热合机、冰冻血浆解冻箱（苏州KJX-IA）、止血钳、塑料夹子、电子配平仪、压浆板、空袋、一次性使用塑料冷冻血袋（三株袋，山东威高)、一次性使用输血器(山东威高)、57%复方甘油溶液(博德桑特)、9%浓氯化钠溶液(山东威高)、五联盐水袋(上海血技)、-80℃冰箱。

1.3方法

1.3.1红细胞甘油化

取RH（D）阴性红细胞悬液，利用无菌接管机将空袋与红细胞悬液的袋子连接，互通后进行离心（3500rpm、17分钟、4℃）。将离心后的红细胞悬液中的上清液与白膜层分入空袋内并把空袋内空气排入母袋后断开（血袋内留空气方便倒带时血液能流出得更彻底），制得浓缩红细胞。打开三株袋后立即热合管道端口。用无菌接管机将血袋和三珠袋连接，把母袋内的红细胞转移至三珠袋内。红细胞转移完后将三珠袋内空气排尽，热合断开母袋。用无菌接管机连接输血器和三珠袋，然后用输血器上的插瓶针与甘油连接。通过输血器将甘油加入红细胞内。加入时严格控制滴速：前5分钟60-80滴/分，5分钟后加快至100～120滴/分直至加完。复方甘油加注量：1.0u血液加入160ml甘油；1.5u血液加入240ml甘油；2.0u加入320ml甘油。加注过程必须匀速震荡。复方甘油加注完毕后排气、热合、断开，两根管路端口处均热合两次（以防冰冻过程中热合口炸开）。室温放置30分钟，制得冰冻红细胞。置于-80℃冰箱内保存。

1.3.2解冻去甘油

1.3.2.1启动水浴箱升温至37～40℃，取冰冻红细胞在水浴箱中解冻。将血袋完全浸没在水中，轻摇的同时检查冰冻红细胞血袋和辫管是否有裂痕和渗漏等。解冻过程中切勿用手捏碎血袋内冰块，待冰块完全融化后取出，大概4～6分钟。用毛巾擦拭表面的水分，静置10分钟。

1.3.2.2使用无菌接管机接上空袋后离心（3000rpm、10分钟、4℃），取出后去除上清液，断开空袋。用输血器将三珠袋与浓氯化钠溶液连接，以80～100滴/分的速度摇摆状态下滴入（每1U加80ml浓氯化钠溶液），加毕室温下静置5～10分钟。再用无菌接管机让三珠袋与五联盐水袋连接。加入生理盐水300～400ml混匀，静置5～10分钟后再次离心（2500rpm、8分钟、4℃）。离心后操作同前挤出上清液，再次灌入生理盐水混匀。按以上程序反复用生理盐水洗涤3-4次，直到上清液清亮为止。为防止血袋离心破裂，可在中途将血液转移至新血袋再继续离心。最后加入生理盐水1U加至200ml、1.5U加至300ml、2U加至400ml。留取至少20cm长分段热合并注满终产品的血辫供临床做主侧交叉配血。

2.结果

质量检测：游离血红蛋白≤lg/L,残余甘油含量≤10g/L；红细胞回收率>80%；体外溶血实验<50%，无细菌生长。符合2012版《全血及成分血质量要求》。

3.讨论

甘油是最常用的防冻剂。（1）高度甘油慢冻法（甘油浓度40%）存入-80℃低温冰箱保存，可保存3年。（2）低浓度甘油超速度冷冻法（甘油浓度20%），存入-196℃液态罐中，可保存十年以上。目前，我站将甘油保存红细胞技术用于Rh（D）阴性等稀有血型血液的长期保存。由于甘油渗透压较高，在加入甘油时一定要先控制速度，由慢到快，逐渐提高滴速，并使血液制剂的血袋始终保持震荡状态，让甘油缓慢均匀地和红细胞混合。甘油加完后一定要静止30min。加甘油前，和加完甘油都要排尽血袋内空气，如果血袋内气泡太多在形成大气泡的过程中，小气泡需不断破裂，这样对红细胞是一个种损害。解冻去甘油时水浴箱的水一定要浸没血袋，不断摇动，使血袋与水充分接触，加速其融化，减少红细胞在溶化过程中的机械损伤，溶化好的血袋要在室温静置10min，让血红细胞得到充分休息，增强细胞的抗破坏能力。然后采用梯度洗涤法，先用高渗盐水9%浓氯化钠使甘油从红细胞内逐渐释放出来，再用0.9%的生理盐水洗涤。逐渐降低渗液的浓度，而且每次加完洗液后一定要平衡5～10分钟后再离心。此外，在整个洗涤过程中均使用无菌接驳机接通各种溶液袋，保证血液在全封闭环境下制备，防止细菌污染，整个洗涤过程只需一位工作人员操作。终产品经质量检测结果证实各项检测指标均符合国家《全血及成分血质量要求》2012版。冰冻红细胞解冻时采用渗透压梯度递减法洗涤后，红细胞又可以恢复正常的生理机能。人体输入甘油解冻红细胞后，血液中残存少量的甘油和游离血红蛋白可以被体内的血液稀释并通过肾脏逐渐排出体外是较为安全的。此方法尤其适合中小型血站、偏远地区血站的开展,值得大力推广应用。

【参考文献】

[1]王万仲.手工密闭式制备冰冻解冻去甘油红细胞方法研究[J].医学检验,2012.01.006.

[2]梁艳.手工密闭式制备冰冻解冻去甘油红细胞的可行性研究[J].贵州医药,2016年6月第40卷第６期.

[3]庄培芬,王建平.冰冻红细胞手工制备过程初探[J].现代中西医结合杂志,2007-06-04.