多药耐药基因单核苷酸多态性与Ph+白血病伊马替尼耐药相关性研究

多药耐药基因单核苷酸多态性与Ph+白血病伊马替尼耐药相关性研究

倪玲娜1徐建忠1陆超

倪玲娜1徐建忠1陆超2

（1苏州大学附属常州肿瘤医院肿瘤内科213001）

（2苏州大学附属常州肿瘤医院临床药学室213001）

【摘要】本研究探索Ph+白血病中多药耐药基因（MDR1）1236位点多态性与伊马替尼耐药的关系。用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测52例服用伊马替尼的Ph+白血病患者中C1236T的单核苷酸多态性(SNPs)的表达。结果标明：耐药组与非耐药组患者在C1236T的SNPs表达有显著性差异(p<0.05)，且伊马替尼耐药与等位基因T呈剂量相关效应。结论MDR1该SNPs中,等位基因T与伊马替尼耐药相关,体现基因剂量效应。检测Ph+白血病中MDR1SNPs的表达在分析患者对伊马替尼是否有良好疗效中可能具有预测意义。

【关键词】MDR1SNPs伊马替尼耐药

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）32-0140-02

MDR1SingleNucleotidePolymorphismsinImatinib-ResistantPhiladelphiaChromosome-PositiveLeukemias

NiLingna[1]XuJianzhong[1]haoLu[2]

1.DepartmentofOncology,ChangzhouCancerHospital,AffiliatedofSoochowUniversity,Changzhou213001.2.ClinicalPharmacydepartmentofPharmacy，ChangzhouCancerHospital,AffiliatedofSoochowUniversity,Changzhou213001.

【Abstract】ObjectiveTheaimofthisstudywastoevaluatetheimportanceofMDR1polymorphismsinimatinib-resistantPhiladelphiachromosome-positive(Ph-positive)leukemias.MethodsC1236TSNPsofMDR1wasdetectedbyPCR-RFLPin52patientswithPh-positiveleukemiatreatedwithimatinib.ResultsTheSNPsexpressionisstatisticallylinkedtotheidentificationofpatientswhomayormaynotrespondoptimallytoimatinib.ConclusionThedrugresistanceofimatinibcorrelatedwiththenumberofTallelesatlocus1236.OurdatasuggeststhatMDR1SNPstestedbyRFLP-PCRisausefulmoleculartooltoidentifyhowpatientsrespondtoimatinib.

【Keywords】MDR1SNPsimatinibdrugresistance

尽管酪氨酸激酶竞争性抑制剂甲磺酸伊马替尼（简称伊马替尼）对Ph+白血病有着显著的疗效[1],Abl激酶结构域获得性点突变、BCR-ABL基因组或转录水平扩增是伊马替尼耐药的常见原因。2011年Qin等报道了Abl激酶突变在中国人群伊马替尼耐药CML患者中的分布[2]。多药耐药(multidrugresistance,MDR)基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)可以预测患者对伊马替尼的反应。我们对52例伊马替尼治疗的Ph+白血病患者分析此SNPs，分析MDR1-SNPs基因表达与Ph+白血病伊马替尼耐药的相关性。

对象与方法

1研究对象

标本取自江苏省苏州大学附属常州肿瘤医院1993年6月至2012年8月门诊及病房收治的52例服用伊马替尼的Ph+白血病患者的骨髓或外周血。其中慢性粒细胞白血病(chronicmyelogenouslekemia,CML)48例(慢性期35例，进展期11例，急变期2例)，Ph+急性淋巴细胞白血病(Ph-positiveacutelymphoblasticleukemia,ALL)患者4例。诊断及分型均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[3]。

所有患者均接受伊马替尼治疗，CML慢性期患者400mg/d，加速期、急变期患者600或800mg/d，ALL患者诱导化疗后开始服用伊马替尼400～600mg/d。患者每2～4周复查血常规，每三个月复查骨髓形态学及染色体核型(R显带方法)，伴有骨髓纤维化的患者行骨髓活检。达完全血液学缓解(CHR)、完全细胞遗传学缓解(CCR)或部分细胞遗传学缓解(PCR)的患者构成非耐药组，共27例。

基因组DNA的提取：取肝素抗凝，通过密度梯度离心法将单个核细胞从外周血或骨髓标本中分离出来。用酚-氯仿法抽提基因组DNA，置-80℃备用。

2引物设计

MDR1(C1236T)引物由PrimerExpresssoftware2.0(AppliedBiosystems,Canada)设计。引物序列及产物长度：1236Creverse5′-CTGCACCTTCAGGTTCTGG-3′；1236Treverse5′-CTGCACCTTCAGGTTCGGA-3′；1236forward5′-GTCACTTCAGTTACCCATCTCG-3′；长度36bp。由上海英骏生物技术有限公司设计合成。

3RFLP-PCR反应

RFLP-PCR反应体系：DNA25ng，10mmol/L的上、下游引物各0.5l，MasterMix10l，加去离子水至终体积20l。PCR扩增循环参数：94℃3min→（94℃30sec→58℃30sec→72℃20sec）×10个循环→（96℃30sec→55℃30sec→72℃20sec）×25个循环→72℃2min→4℃∞。

配制2%的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶，取5μlPCR产物加样，于0.5×TBE缓冲液中，90V电泳30min，紫外灯下观察结果并照相。阳性条带回收、纯化，由上海英骏生物技术有限公司测序。

4统计学处理

SPSS13.0统计软件进行x2检验分析，p值<0.05有统计学差异。

结果

52例Ph+白血病患者耐药组25例(48.1%)，非耐药组27例(51.9%)。MDR11236CC、CT和TT基因型的总频率分别是25%、36.5%、38.5%。耐药组与非耐药组在C1236T基因型表达有显著差异(p<0.05)(表1、图1)。

Table1.

Figure2.GenotypesofMDR1

（Blackindicatestheresistanceofimatinib,andgray,noresistanceofimatinib）

讨论

具有高度多态性的MDR1中其中1236位点的SNPs具有改变蛋白质功能和影响药物吸收、清除的潜能[4],进而影响血浆药物浓度等。CML患者的细胞遗传学和分子效应与伊马替尼血浆浓度具有相关性[5-6]。故该SNPs可部分解释白血病患者对伊马替尼的差异性反应。

纯和TT表型患者伊马替尼耐药率显著高于CT/CC表型患者（75%VS31.3%，p=0.004）。这些数据提示该SNPT的基因剂量与伊马替尼耐药相关，即等位基因T剂量大者的伊马替尼耐药率相对要高。

从上述分析中可以看出，MDR1C1236T在Ph+白血病患者的伊马替尼耐药组与非耐药组的表达具有差异性，且与等位基因T呈剂量相关。我们将进一步扩大样本量并比较耐药率的变化，以进一步证实MDR1SNPs可作为鉴别患者对伊马替尼疗效反应的有效分子工具，以更好的指导临床治疗。

参考文献

[1]刘霆.Ph阳性急性淋巴细胞白细胞的治疗进展与思考.中华血液学杂志，2012,33:73-75

[2]QinY,ChenS,JiangB,etal.CharacteristicsofBCR-ABLkinasedomainpointmutationsinChineseimatinib-resistantchronicmyeloidleukemiapatients.AnnHematol,2011,90:47-52

[3]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准.第3版.北京:科学出版社.2007:134-136,116-120

[4]GurneyH,WongM,BalleineRL,etal.ImatinibDispositionandABCB1(MDR1,P-Glycoprotein)Genotype.ClinicalPharmacology&Therapeutics,2007;82:33–40

[5]PicardS,TitierK,EtienneG,etal.Troughimatinibplasmalevelsareassociatedwithbothcytogeneticandmolecularresponsestostandard-doseimatinibinchronicmyeloidleukemia.Blood,2007;109:3496-3499

[6]LarsonRA,DrukerBJ,GuilhotFA,etal.Imatinibpharmacokineticsanditscorrelationwithresponseandsafetyinchronicphasechronicmyeloidleukemia:asubanalysisoftheIRISstudy.Blood,2008;111:4022-4028