东营地区儿童病毒性脑膜炎、脑炎63例病原与临床分析

东营地区儿童病毒性脑膜炎、脑炎63例病原与临床分析

郭华（1）陈宗波（2）李慧娟（1）刘文圣（1）颜卫

郭华（1）陈宗波（2）李慧娟（1）刘文圣（1）颜卫红（1）

1东营市人民医院2青岛大学医学院附属医院

【摘要】目的对东营地区2008年～20011年病毒性脑膜炎、脑炎63例患儿进行病原与临床分析。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测63例临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎病人脑脊液的肠道病毒（EV）RNA，并结合临床特点进行分析。结果63例病毒性脑膜炎、脑炎患儿的脑脊液经RT-PCR检测，EV感染阳性率为74.6％(47/63),RT-PCR的全过程可在5小时内可以完成。肠道病毒脑膜炎可以散发或局部暴发,临床特点在各个年龄组有所不同,70.21%的患儿脑脊液中白细胞数不同程度增高(均数为76×106/L)。结论采用RT-PCR可以快速准确的检测出中枢神经系统感染的肠道病毒，此方法敏感性高、省时省力；EV引起的病毒性脑膜炎临床症状一般较轻、无特异性。肠道病毒是东营地区儿童病毒性脑膜炎脑炎最常见的病原。

【关键词】肠道病毒；病毒性脑膜炎、脑炎；逆转录聚合酶链反应

Etiologyandclinicalanalysisof63caseswithChildrenviralencephalitiscerorebromeningitisinDongyingarea【Abstract】ObjectiveToanalyzetheetiologicalandclinicalfeatureof63caseswithviralencephalitiscerorebromeningitisinDongyingareafrom2008to2011.MethodEVRNAwasdetectedin63CSFsampleswiththediagnosisofviralencephalitiscerorebromeningitisbyRT-PCRandanalyzedtheirclinicalfeature.ResultEVwasdetectedpositivein47specimensfromthe63withthediagnosisofviralencephalitiscerorebromeningitisbyRT-PCR,thepositiveratewas74.6%,TheresultsofRT–PCRcanbereportedwithin5hours。EVmeningitiscanbedistributedorlocaloutbreaks,WBCof70.21%CSFincreasedtovaryingdegrees(meanforthe76×106/L).ConclusionTheRT-PCRassaywasrapid,sensitiveandspecificforthediagnosisofEVofcentralnervoussysteminfection.EVisthemostmainpathogeninviralencephalitiscerorebromeningitisinDongyingarea.【Keywords】Enterovirus(EV);viralencephalitiscerorebromeningitis;reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)

病毒性脑膜炎、脑炎是儿童时期最常见的中枢神经系统感染性疾病。据芬兰的一项多中心研究表明儿童脑炎的发病率为每年10.5/105;英国对1989～1998年病毒性脑炎病例统计资料显示每年儿童发病率为2.8/105;日本的一项全国性研究统计显示,病毒性脑炎的年住院率为0.55/105,儿童病例在其中占37.5%，病毒性脑膜炎的年住院率为4.86/105，儿童病例在其中占94.2%[1-3]。其中EV是占病毒性病毒性脑膜炎第一位的病原体。美国统计每年平均一至三千万人发生EV感染,其中EV脑膜炎约五万至七万五千人，EV性脑膜炎占无菌性脑膜炎总数的85%[4、5]。国内研究发现肠道病毒感染占病毒性病毒性脑炎、脑膜炎的69%～84%[6、7]。

为进一步了解东营地区儿童病毒性脑膜炎、脑炎的病原学及临床特点，为病原检测和临床诊治提供重要参考依据，我们对东营市人民医院2008年～20011年病毒性脑膜炎、脑炎住院儿童病例进行回顾性实验室和临床研究分析。对象与方法

一、研究对象和标本采集

临床标本:收集2008年01月至2011年02月东营市人民医院临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎患儿的脑脊液标本，急性期63例，恢复期14例,其中男性患儿43例、女性患儿20例，年龄11天～12岁，平均年龄6.7岁。诊断标准依据诸福棠实用儿科学。收集入院2日内及恢复期(症状体征消失)CSF各1.0ml。所有CSF样本均做常规检查及细菌培养。

阳性对照来自中国科学院昆明生物学研究所提供的EV标准病毒株,包括COXB3、ECHO30和EV71。阴性对照为正常CSF和磷酸盐缓冲溶液。

所有临床标本及阴性对照样本、经稀释后的标准毒株，分装后置于-70℃低温冰箱保存。

二、实验方法

1、RNA的提取和定量:采用改良的酸性胍-酚-氯仿一步法(AGPC)提取。

2、cDNA及PCR扩增：按常规进行，逆转录试剂盒采用Promega公司生产。本研究所用引物选自EV5′非编码区,通用引物[6],引物1：5′-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3′,引物2：5′-CACYGGATGGCCAATCCA-3′,上游引物为完全保守的核苷酸序列,下游引物5′端第四个核苷酸在一部分为T,而另一部分为C。扩增产物为194bp的片段。通过检索基因文库,未发现该引物与自然界经常引起人类感染的EV以外的其他病毒和细菌间有同源序列[8～13]。研究表明[8～13]，阳性对照标本均被成功扩增,而流行性腮腺炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型及人巨细胞病毒扩增检测结果均为阴性。

3、扩增产物的检测:采用2%琼脂糖凝胶电泳的方法检测扩增产物。

三、数据处理

统计学方法采用SPSSV13.0进行卡方检验

结果

一、RT-PCR检测结果

一次PCR检测结果:通用引物对无菌性脑膜炎、脑炎患儿脑脊液急性期63例及恢复期14例进行扩增检测，在急性期获得阳性结果43例（占急性期68.2％），恢复期3例。二次PCR检测结果:采用通用引物阴性标本扩增产物回收后，再次进行PCR扩增，又检测出阳性结果4例。采用通用引物经两次PCR扩增检测急性期样本，共检出阳性结果47例（占急性期74.6％），恢复期3例。结果统计分析，一次和二次PCR检测病毒性脑膜炎、脑炎患儿急性期脑脊液中EVRNA的阳性率差异无显著的统计学意义。

通用引物检测病毒性脑炎、脑膜炎患儿急性期脑脊液标本结果检测结果

统计结论：χ2=0.6222,P=0.4302，P>0.05,两者间无统计学意义.对照组的检测结果

1、阳性对照：三种标准毒株（COXB3、ECHO30、EV71）均被通用引物成功扩增，电泳结果显示为一条清晰的单克隆条带，片断大小为194bp。

2、阴性对照：13例儿外科手术病人的脑脊液（常规和生化检测结果均正常），在通用引物下均不能被扩增检测

3、其他病毒和细菌对照：细菌性脑膜炎脑炎(结核性脑膜炎3例，流感杆菌脑膜炎2例，肺炎球菌脑膜炎1例)在通用引物下均不能被扩增检测。

电泳结果图片如下：

临床样本在通用引物扩增产物电泳图片

1为标准毒株扩增产物电泳条带，2～17为临床标本扩增产物电泳条带三种引物对三种标准毒株（COXB3、ECHO30、EV71）扩增产物电泳图片：

1、2、3分别为标准毒株COXB3、ECHO30、EV71扩增产物电泳条带在不同退火温度梯度下标准毒株扩增产物电泳条带：

1、2、3为标准毒株COXB3，4、5、6为ECHO30，7、8、9为EV71扩增产物电泳条带

阴性对照组通用引物扩增产物电泳图片：

1～7为阴性对照标本扩增产物电泳条带，8为标准毒株扩增产物电泳条带

二、临床表现及CSF常规、生化结果

发热、头痛、呕吐、激惹为发病患儿的主要临床表现。5岁及以上患儿组中，94.12%患儿诉有不同程度的头痛,31.75%患儿有畏光的表现,23.81%的患儿有疲劳、乏力,11.11%的患儿有肌痛,63例脑膜炎急性期患儿中仅有3例发生惊厥,占4.76%。部分患儿因年龄较小不能描述头痛、畏光、疲劳等主观临床症状,因此对客观临床症状进行分析,发现≤5岁患儿组发热、呕吐、腹泻发生率均高于>5岁患儿组,而皮疹阳性率较相近。

47例EV性脑膜炎患儿急性期的CSF中白细胞增高者33,占70.21%,范围从20到790×106/L(均数为76×106/L),其中37例(84.09%)在300×106/L个以内,42例(95.45%)在500×106/L个以内。中性粒细胞大于50%者6例。急性期的CSF中蛋白含量增高者21例,占44.68%，仅2例CSF中蛋白含量大于800mg/L。CSF中糖含量降低者16例,占34.04%,仅1例CSF中糖含量小于2.0mmol/L。分析发现,CSF中白细胞记数、中性>50%者异常率均有随年龄增高趋势,CSF中蛋白和糖含量异常率均有随年龄增长而下降趋势，两者均表现为小于3岁年龄组高于3岁以上年龄组。14例证实有EV感染的CSF中白细胞数不增高。

讨论

随着抗生素的广泛应用和卡介苗的普遍接种,化脓菌和结核菌造成的脑膜炎、脑炎的发病率日趋降低,而病毒性脑膜炎、脑炎日益增多,已成为最常见的中枢神经系统感染疾病。肠道病毒主要通过血循环侵犯中枢神经系统，绝大多数引起脑膜炎，据统计,美国无菌性脑膜炎中85%系EV性脑膜炎[4、5],在国内，专家研究表明其所占无菌性脑膜炎的82.9％[6、7]。

本研究采用RT-PCR方法，以通用引物，对3株阳性标准毒株，77例无菌性脑膜炎、脑炎临床标本及阴性对照组进行扩增检测，结果表明：3株阳性标准毒株（COXB3、ECHO30、EV71）经RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，产物均显示一条长度约为194bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增；所有对照标本（外伤患儿、细菌性脑膜炎CSF）均不能被扩增检测。说明以通用引物进行RT-PCR检测方法特异性强、可靠性高。在63例临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎的急性期CSF标本中47例可检测到清晰的单克隆条带，占总例数的74.6％，与国内外相关研究基本一致[4、5、6、7],，说明在无菌性脑膜炎、脑炎中，肠道病毒仍是占第一位的病原体。

肠道病毒脑膜炎可以散发或局部暴发,临床特点在各个年龄组有所不同,在EV感染的患儿中,以发热、呕吐最为常见,大于5岁患儿多数（94.12%）自述有不同程度的头痛,而小于5岁患儿多表现为易激惹。大于5岁部分患儿有疲劳、肌痛及畏光的表现,而小于3岁者相对腹泻、皮疹发生率较高，另有少数患儿以惊厥为主要表现，分析原因可能为我们所取样本中以轻症的病毒性脑膜炎患儿居多。我们的研究结果与之一致。肠道病毒引起的中枢神经系统感染主要是脑膜炎,但是有10%～20%的脑炎是由肠道病毒引起的，血清型和临床损害缺乏明确的对应关系，在我们本次研究中，部分肠道病毒性脑炎临床表现严重，恢复较慢，个别患儿留有不同程度的后遗症。本组63例病毒性脑膜炎、脑炎急性期病人的CSF中,RT-PCR检测EV感染的阳性率74.6%,国内外报道EV在病毒性脑膜炎病原体中82.9%～85%[4、5、7],在病毒性脑炎中占10%～20%[4、13、14]，分析可能为在我们获得的临床病例患儿中，病毒性脑膜炎所占比例较大。本研究中大多数病例是发生在东营地区2008至2011的的夏秋季,其他呈散发性感染。推测EV感染可以散在发生,某个血清型在某个地区亦可发生局部暴发流行。14例处恢复期的CSF样本,RT-PCR检测仅有3例阳性，提示EV主要为急性期感染。是否存在EV慢性低滴度持续性感染,需进一步进行长期的随访、观察研究。

统计结果显示,70.21%的EV性脑膜炎患儿的CSF中白细胞数高于正常范围,其中84.09%在300×106/L内,95.45%在500×106/L以内。CSF中蛋白及葡萄糖的定量多在正常范围内，仅有少部分病例发生轻度改变,此与Sawyer等[15]研究结果一致。部分EV脑膜炎患儿可出现心肌酶升高和转氨酶（谷丙转氨酶或谷草转氨酶）异常,考虑可能与不同的EV血清型对不同器官的感染和损伤选择性差异有关。部分EV脑膜炎患儿CSF中白细胞数可不增高，是否与部分病人病情较轻、病程较早有关,尚需进一步探讨。

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15SawyerMH,HollandD,AintablianN,etal.Diagnosisofenteroviralcentralnervoussysteminfectionbypolymerasechainreactionduingalargecommunityoutbreak[J].PediatrInfectDisJ,1994,13:177-182.（上接第195页）HAMD减分率经t检验比较，p均<0.01。

2．3两组CGI-SI评分比较见表2。

表2治疗前后两组CGI-SI评分比较n=31，（χ±s）

*

表2显示，度洛西汀与氟西汀两组治疗后病情严重程度（CGI-SI）均较治疗前有显著性改善；两组间比较差异无显著性（p>0.05）。

2.4不良反应心理护理组不良反应发生率为22.6%（7/31），有食欲下降3例，恶心3例，腹泻、腹痛各2例，口干、便秘各2例，头痛、头晕各2例；单用药物组发生率为32.2%（10/31），有口干8例，便秘6例，视物模糊5例，心动过速4例，恶心2例，嗜睡2例，失眠4例。

3讨论

目前认为老年抑郁症的治疗效果及预后较中青年为差，其中治疗的依从性为主要原因之一，因此老年抑郁症的药物选择尤为重要。根据老年人的生理特点，理想的抗抑郁药应无心脏效应和体位血压降低效应，镇静作用少，对记忆和体力无损害【6】。

本研究结果发现实施心理护理干预的老年抑郁症患者较单纯基本护理对缓解病情有明显帮助。治疗第一周末心理护理组HAMD评分明显低于单用药物组，差异有显著性；老年阶段(≥60岁)是人类一生发展过程中的特殊阶段，老年人具有独特心理和生理特点。例如老年人有形态老化、各系统机能减退、动作迟缓、感觉迟钝记忆力减退等生理特点【7】。老年人由于以上生理特点的出现，容易产生自卑感，也由于离退休或社会角色的变化或疾病的影响，老年人容易产生失落感、孤独感、抑郁等心理特点【8】。随着时代的发展，我国已进入了老龄化社会，预计到2040年我国老年人口将达到4亿多，点总人口的27．2%，占全世界老年人口的22%，特别是80岁以上的老年人口将由1300万增加到7400万。在患有躯体疾病的老年人中，抑郁症的患病率可高达50%，而且随年龄增长呈不断上升的趋势，越来越多的老年病人需要我们的护理和帮助。传统的护理模式是以完成任务为中心，它的最大弊端是使护士形成只关心工作，不关心患者的行为模式【7】。因此，患者只是被动地接受检查、治疗和护理，其感受、情绪和需求都得不到护理人员的重视，而心理护理是以患者为中心，以现代护理观念为指导，以护理程序为框架，对患者实施身心整体护理。实施心理护理可使抑郁症患者抑郁症病情得到很好的控制，耐心地向患者解释各种治疗护理措施细节，可使其对治疗有安全感，消除焦虑、忧郁等负性情绪，患者能自觉参加更多的社会活动，提高了生活质量和保健意识。本研究表明,口服度洛西汀联合心理护理治疗老年抑郁症急性期疗效可靠,安全性较好。具有较好的依从性和耐受性，适用于老年抑郁症患者。

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