HPLC法测定头孢布烯中有关物质的含量

HPLC法测定头孢布烯中有关物质的含量

陈司汉邓俊丰蒲强红陈孜孜

陈司汉邓俊丰蒲强红陈孜孜（乐山职业技术学院四川乐山614000）

【摘要】目的建立以高效液相色谱法测定头孢布烯中有关物质含量的方法。方法色谱柱为DiamonsilC18(250×4.6m,5μm)；流动相为0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液（5%氢氧化钠调节pH值至7.0）-甲醇（95:5）；流速为1.0ml·min-1；检测波长263nm；柱温为30℃，进样量为20μl。结果头孢布烯检测浓度的线性范围为0.05～1014μg·mL-1（r=1.0000），检测限为0.6ng(S/N=3)。结论本方法专属性好，准确度高，适用于本品的有关物质检测。

【关键词】HPLC头孢布烯有关物质

【中图分类号】R927.2【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2012）20-0295-03

头孢布烯（ceftibuten，商品名：先力腾）是日本盐野义制药公司研制的第三代口服头孢菌素类抗生素，由美国Schering-Plough公司生产进口。它对β-内酰胺酶具有高度稳定性，其最大的特点是口服吸收速度快、吸收良好，能被肠杆菌β-内酰胺酶在肠内降解。目前国内尚未见生产及质检方面的报道，日抗基1998年版及日本药局方（第十五改正本）收载了该品种，但未收载有关物质方法，其含量测定方法采用了反相高相液相色谱法，流动相为0.005mol/L溴化癸基三甲基铵溶液-乙腈（4:1），此离子对试剂目前国内很难买到，且对普通色谱柱损害比较大。本文建立了采用磷酸二氢钠缓冲液-甲醇体系分离头孢布烯中有关物质的方法。

1仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪-二极管阵列检测器，chemstation色谱工作站。

头孢布烯研究用样品，四川抗菌素工业研究所提供；头孢布烯对照品，某厂提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：DiamonsilC18(250×4.6mm,5μm)；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液（5%氢氧化钠调节pH值至7.0）-甲醇（95:5）；流速为1ml·min-1；柱温：30℃；检测波长：263nm；进样量：20μl。理论板数按头孢布烯峰计算，应不低于2500。

2.2溶液的配制

供试品溶液：取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：取1ml供试液，至100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适应性溶液：取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加入1ml1mol.L-1盐酸溶液于室温下放置4小时，再加入1ml1mol.L-1氢氧化钠溶液使其至中性，流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3系统适用性实验

精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以头孢布烯峰计算理论板数应不低于2500，与相邻杂峰分离度不低于1.5，E-异构体峰保留时间约为头孢布烯峰保留时间的1.4倍，E-异构体峰与头孢布烯色谱峰的分离度应不小于1.5。色谱图详见图1。

图1头孢布烯高效液相色谱图

A.头孢布烯对照溶液；B.系统适应性溶液

2.4测定法

取“2.2”项下对照液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%～20%，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液中如显杂峰，按不加校正因子主成分自身对照法，以对照溶液主峰面积计算各杂质峰的含量。

2.5与降解产物的分离

取本品分别进行高温、高湿、强酸、强碱、氧化、光照破坏性试验，考察头孢布烯色谱峰与降解产物的分离情况。

2.5.1光照降解产物的分离

取本品，置于（4500±500）Lx强光下照射10天后，按“2.2”项下方法制备成溶液。

2.5.2高湿降解产物的分离

取本品，置于湿度为92.5%的环境下10天后，按“2.2”项下方法制备成溶液。

2.5.3高温降解产物的分离

取本品约10mg，置10ml量瓶中，加入0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度。放置于60℃温度下3小时，待冷却后作为高温破坏试验供试液。

2.5.4酸降解产物的分离

取本品约10mg，置10ml量瓶中，加入1ml1mol.L-1盐酸溶液，室温下放置4小时后，加1ml1mol.L-1氢氧化钠溶液中和至中性，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏试验供试液。

2.5.5碱降解产物的分离

取本品约10mg，置10ml量瓶中，加入1ml1mol.L-1氢氧化钠溶液，立即加入1ml1mol.L-1盐酸溶液中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏试验供试液。

2.5.6氧化降解产物的分离

取本品约10mg，置10ml量瓶中，加10%H2O2溶液1.0ml，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏试验供试液。

取上述溶液各20μl，进样测定，记录色谱图。结果，本方法能有效检测出各破坏性试验中产生的降解产物，且降解产物峰均能与主成分峰达到基线分离，表明本方法对相关产物检查的专属性较好。

2.6线性关系考察

取头孢布烯对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。再精密移取贮备液，采用流动相稀释至系列浓度（见表1）。分别精密量取各浓度对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以头孢布烯峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程A=31.696C+7.8972（r=1.0000，n=7）。结果表明，头孢布烯检测浓度的线性范围为0.05～760.5μg.mL-1。

表1头孢布烯线性试验结果

2.7检测限考察

取头孢布烯对照品适量，加流动相使其溶解，并逐级稀释，按照“2.1”项下色谱条件，取各溶液20μl进样测定。结果表明：当信噪比约3:1时，检测限为0.6ng。

2.8检测方法的精密度试验

精密称取本品适量，按“2.2”项下方法配制头孢布烯供试品溶液及对照溶液各6份，分别进样测定，以供试品溶液中杂质含量考察方法精密度。结果，最大单杂RSD为3.82%，总杂质的RSD为0.93%。

2.9溶液稳定性

照“2.2”项下方法配制供试品溶液及对照液，供试品溶液分成2份，分别放置于避光与不避光的条件下，在0、2、4、6、8小时的时间点取样，精密吸取各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以归一法计算供试品溶液中杂质的含量，见表2，结果表明：在2个小时之内测得的值变化不明显，本品在溶液中不够稳定，建议现配现测。

表2头孢布烯溶液稳定性考察试验结果

2.10耐用性试验

调节色谱条件中pH、柱温在微小范围内变化，更改色谱柱的品牌，考察本方法的耐用性。结果表明：流动相的pH值及柱温微小变化对色谱分离影响不大，不同品牌色谱柱采用本方法进行有关物质检查，测得结果均较好，本法耐用性较好。

3讨论

对日抗基1998年版[1]及日本药局方（第十五改正）[2]收载的标准方法及国内文献[3-4]研究的方法进行了预实验，结果表明：甲醇-磷酸缓冲盐体系对本品的杂质峰分离效果最好，杂峰数目最多，主峰对称性较好，保留时间约为10min，该体系较适合进行本品有关物质检查。

3.1有机相选择

随着甲醇比例的改变，头孢布烯主峰的保留时间变化较大，甲醇比例为5%时杂峰间的分离效果最好，故确定甲醇比例为5%。

3.2磷酸盐浓度

流动相的比例及pH值不变，考察磷酸二氢钠浓度变化时对色谱行为的影响,试验结果表明：当磷酸二氢钠浓度为0.05mol/L时，头孢布烯主峰对称性最好，与相邻杂峰分离度大于2.0，且杂峰数目最多，故选择磷酸盐浓度为0.05mol/L。

3.3pH值的选择

采用10%磷酸或5%氢氧化钠溶液调节pH值在3.0～7.0范围内变化，结果表明：pH值越低，主峰的理论板数越低，在5.5～7.0范围内色谱行为变化不大，当pH为7.0时，主峰的对称性及其与杂峰的分离度最好，故选择pH为7.0最佳。

3.4检测波长的选择

检测波长的选择主要考虑头孢布烯及其主要的中间体和杂质的紫外吸收特点，对头孢布烯及其起始原料、中间体进行紫外扫描，结果均在263nm处均有较好吸收，此外，为避免漏检杂质，采用HPLC-DAD对头孢布烯酸破坏样品进行全波长（200～400nm）范围内扫描，结果表明：由在线紫外图分析可以得出各杂质在263nm处均较大吸收。

3.5柱温

柱温对主峰的保留时间影响较大，温度越高，保留时间越短，主峰的对称性均较好，与杂峰的分离度无差异性，在30℃时，主峰理论板数最高，保留时间较合适，故选择柱温为30℃。

参考文献

[1]日本厚生省.日本抗生物质医药品基准解说.东京：药业时报社，1998.

[2]日本药局方.JPⅩⅤ.2006.

[3]吕东玉，宋爱刚，张伟，等.头孢布烯含量及有关物质的HPLC分析测定[J].中国处方药，2005,11:36～38.

[4]代红，王俊秋，等.头孢布烯及有关物质的HPLC测定[J].中国抗生素杂志，1999,24（1）：26～27,38.

（本文属：乐山职业技术学院科学研究计划项目。项目名称：头孢布烯有关物质测定方法的研究。申报编号：KY2012007。项目负责人：陈司汉）