一种新型抗乳腺癌双重靶向性融合蛋白的诱导表达和纯化

一种新型抗乳腺癌双重靶向性融合蛋白的诱导表达和纯化

顾丽1杨丽2丁海麦3魏春华3苏燕3(通讯作

顾丽1杨丽2丁海麦3魏春华3苏燕3(通讯作者)

(1内蒙古科技大学包头医学院病原生物学教研室内蒙古包头014060)

(2内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科内蒙古包头014060)

(3内蒙古科技大学包头医学院生物化学与分子生物学教研室内蒙古包头014060)

【摘要】目的：将已构建好的新型抗乳腺癌双重靶向性融合蛋白Del1-9-G129R-T3的原核表达载体转化入原核表达宿主，诱导融合蛋白的表达，对之进行鉴定后进行分离纯化。方法：将融合蛋白重组表达质粒pET22b-Del1-9-G129R-T3转化入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导融合蛋白表达，收集菌体进行超声破碎，高速离心分离沉淀和上清。通过SDS-PAGE和Westernblot对目的蛋白的表达进行检测和鉴定，利用亲和层析纯化融合蛋白。结果：SDS-PAGE结果显示，在诱导表达菌超声破碎后的沉淀物中出现一与预期分子量约24.7kD大小相吻合的新蛋白区带，表明融合蛋白可能主要存在于细胞质中，形成不溶性包涵体。Westernblot分析显示，蛋白在预期分子量处出现印迹。结论：融合蛋白Del1-9-G129R-T3已经在大肠杆菌中高效表达，为下一步融合蛋白的功能研究奠定基础。

【关键词】乳腺癌人催乳素受体拮抗剂肿瘤抑素融合蛋白Del1-9-G129R-T3

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）03-0084-02

Inducibleexpressionandpurificationofanovelfusionproteinofdual-targetinganti-breastcancer*

GULi1,YANGLi2,DINGHai-mai3,WEIChun-hua3,SUYan3△(BaotouMedicalCollege,UniversityofScienceandTechnology1.DepartmentofpathogenBiology;2.LaboratoryoftheFirstAffiliatedHospital;3.Departmentofbiochemistryandmolecularbiology,Baotou014060,China)

【Abstract】ObjectiveTotransformtheprokaryoticexpressionplasmidexpressingafusionproteinofdual-targetinganti-breastcancer,Del1-9-G129R-T3,intoE.coliexpressionhost,andtheninduceandidentifytheexpressionoftargetprotein.MethodsTherecombinantprokaryoticexpressionplasmidpET22b-Del1-9-G129R-T3wasfirsttransformedintoE.coliBL21(DE3).TheexpressionoftargetproteinwasinducedbyIPTG.Bacteriawerethencollectedandultrasonicallypulverized,followedbycentrifugationandisolationoftheprecipitationandsupernatant.Finally,analyzedanddetectedtheexpressionoffusionproteinbymeasofSDS-PAGEandWesternblot.Thefusionproteinwaspurifiedbyaffinitychromatography.ResultsSDS-PAGEresultsshowedannewproteinbandinthebacterialprecipitation.ThesizeofthenewproteinwasidenticaltotheexpectedmolecularweightofDel1-9-G129R-T3(about24.7kD).Thesefindingssuggestedthatfusionproteinmaymainlylocateinthecytoplasmandexistintheformofinsolubleinclusionbodies.Westernblotanalysisdemonstratedthattheinducibleproteinappearedblotatexpectedmolecularweight.ConclusionTheDel1-9-G129R-T3fusionproteinwasexpressedinE.coli,whichpavethewayforfurtherinvestigationonitsfunction.

【Keywords】BreastcancerDel1-9-G129R-hPRLTumstatinFusionproteinDel1-9-G129R-T3

前言

靶向技术是近年来肿瘤研究的热点，“靶向治疗”就是应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物。根据靶向部位的不同，肿瘤靶向治疗又可分为肿瘤血管靶向治疗和肿瘤细胞靶向治疗两大类。肿瘤血管靶向疗法是通过肿瘤区域新生毛细血管内皮细胞表面的特异性受体或抗原发挥作用，而肿瘤细胞靶向疗法则是利用肿瘤细胞表面表达的特异性受体或抗原作为靶向[1,2]。

本研究联合肿瘤细胞和肿瘤血管双重靶向性，将具有特异性抑制乳腺癌细胞增殖作用的第二代人催乳素受体（humanprolactinreceptor，hPRLR）拮抗剂Del1-9-G129R-hPRL[3-6]与具有特异性抑制肿瘤血管生成活性的肿瘤抑素(tumstatin)[7,8]核心活性部位T3肽进行桥连，构建抗乳腺癌双重靶向性融合蛋白Del1-9-G129R-T3的原核表达质粒，诱导蛋白表达，经检测鉴定后进行分离纯化，为下一步融合蛋白功能检测奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

E.coliBL21(DE3)、His?Tag小鼠单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、IDAHis?BindColumn、PVDF膜均购自德国默克Novagen公司，蛋白分子量Marker购自大连TaKaRa公司，脱脂奶粉购自黑龙江省完达山乳业股份有限公司，ECL显色液、显影液、定影液、X光胶片均购自Kodak公司。

细菌裂解液：Tris-HCl（pH8.0）50mM，EDTA2mM，NaCl100mM，溶菌酶100μg/mL，TritonX-1000.1%。

1.2方法

1.2.1重组质粒转化大肠杆菌将构建好的融合基因原核表达质粒pET22b(+)-Del1-9-G129R-T3转化入大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中，接种于含100mg/L氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取微量单克隆菌作为模板，进行PCR初鉴定，阳性克隆经小量培养后提取质粒并进行双酶切鉴定。

1.2.2融合蛋白的诱导表达将鉴定后的单克隆菌落接种于含Amp的5mLLB液体培养基中，37℃170rpm振摇培养约14-16h。将培养物按1：100转接于含Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm振摇培养至OD600值为0.6~0.8。加入终浓度1.0mmo1/L的IPTG，继续37℃诱导4h，4℃12000rpm离心10min收集菌体，PBS洗涤二次，重悬菌体于等体积细菌裂解液，冰上超声破碎细胞（超声10s，间隔10s，共30次）。4℃12000rpm，离心10min分离沉淀和上清，分别作为蛋白样品，用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.3SDS-PAGE检测融合蛋白的表达以经相同超声处理未诱导菌作阴性对照，向待检样品中分别加入等体积2×SDSLoadingbuffer，混匀后沸水浴5min，低速离心后上样，进行100V恒压SDS-PAGE（浓缩胶5%，分离胶10%）。电泳结束后考马斯亮蓝R250染色、漂洗后观察结果。

1.2.4Westernblot鉴定融合蛋白的表达SDS-PAGE两份样品，电泳结束后一份染色作为参照，另一份进行免疫印迹（Westernblot）鉴定。4℃转膜2-3h，转印PVDF膜经10%牛奶封闭非特异性抗原位点，以His?Tag小鼠单克隆抗体为一抗（1:1000），稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为二抗（1:10,000）进行免疫杂交，ECL显色后曝光和显影。

1.2.5融合蛋白的纯化利用可与随目的蛋白融合表达的His-Tag特异性结合的亲和树脂IDAHis?Bindcolumn对融合蛋白Del1-9-G129R-T3进行分离纯化。按照IDAHis?Bindcolumn试剂盒要求，对大肠杆菌胞质中的融合蛋白包涵体进行分离、洗涤，去除杂质蛋白，再溶解包涵体。以尿素为洗脱剂，在变性条件下进行亲和层析，洗脱的浓缩收集物即为纯化的Del1-9-G129R-T3蛋白溶解液。对纯化产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定，方法同前。将获得的蛋白溶解液经冷冻干燥处理后-80℃保存备用。

2结果

2.1SDS-PAGE检测融合蛋白的表达

转化有pET22b(+)-Del1-9-G129R-T3重组质粒的E.coliBL21（DE3）经IPTG诱导后，超声破碎菌体分离沉淀（包涵体）和上清（可溶蛋白）进行SDS-PAGE电泳，结果显示，在沉淀中20.1~29.0kD之间出现一条新蛋白区带，与融合蛋白Del1-9-G129R-T3预期分子量24.7kD大小相吻合，说明说明外源基因已经成功地在大肠杆菌中表达，蛋白主要以不溶性包涵体形式存在于胞质中，经区带灰度扫描分析，融合蛋白约占大肠杆菌表达蛋白总量约40%（图1）。

图1聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Del1-9-G129R-T3的表达

Fig.1SDS-PAGEdetectiontheexpressionofpET22b-Del1-9-G129R-T3

1:Supernatantoftheuninducedbacteria;2:Supernatantoftheinducedbacteria;3:Precipitationoftheuninducedbacteria;4:Precipitationoftheinducedbacteria;M:Proteinmolecularweightmarker.

2.2Westernblot鉴定融合蛋白表达

Westernblot鉴定（图2）结果显示，在约24.7kD处出现明显蛋白印迹，说明融合蛋白Del1-9-G129R-T3已成功在大肠杆菌中表达。

图2免疫印迹检测Del1-9-G129R-T3的表达

Fig.2WesternblotdetecttheexpressionofDel1-9-G129R-T3

1:UninducedBL21(DE3)/pET-22b-Del1-9-G129R-T3;

2:InducedBL21(DE3)/pET-22b-Del1-9-G129R-T3.

3讨论

近年来多功能靶向治疗成为肿瘤生物治疗的方向，联合多种功能蛋白开发出不仅特异性高、杀伤力强、作用靶点多，而且毒副作用小、给药途径多样的抗肿瘤药物，从而可以发挥协同、高效、多重抗肿瘤活性。目前国外已经有乳腺肿瘤多靶向治疗蛋白的报道，并取得了一定的疗效[9,10]，如Beck等人构建的新型融合蛋白G129R-endostatin[11]。本实验在此基础将PRLR拮抗剂由第一代G129R-hPRL置换为第二代Del1-9-G129R-hPRL，将内皮抑素（endostatin）置换为功能更强大、分子量更小的tumstatin核心活性部位T3肽[12-14]，以期构建的Del1-9-G129R-T3融合蛋白能实现双重靶向性，可以发挥特异性抑制乳腺癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，以及特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增殖，抑制肿瘤血管生成的双重活性，从而有效抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。作为一种颇具潜力的新型生物工程抗癌药物，它将为今后多功能分子靶向抗癌药物的设计合成提供依据，同时为乳腺癌的基因治疗提供新的方法。

融合基因重组质粒pET-22b-Del1-9-G129R-T3转化菌经IPTG诱导表达后，在超声破壁后的菌体沉淀中出现与融合蛋白预期分子量相吻合的新蛋白条带，Westernblot鉴定融合蛋白成功表达。据此判断，融合蛋白Del1-9-G129R-T3主要以不溶性包涵体形式存在于胞质。分析原因为在pET载体强启动子条件下外源基因高效、过度表达，使蛋白未能及时有效折叠，从而无规则卷曲形成固体颗粒或不溶性聚合物堆积于胞质中，亦即包涵体。转化菌经超声粉碎细胞后通过离心分离沉淀和上清，包涵体就存在于离心所得沉淀中，而可溶性蛋白存在于上清中。由于pET载体带有6个组氨酸标签（6×His?Tag），位于融合蛋白C端可与之融合表达，因此可以利用His?Tag的单克隆抗体对融合蛋白的表达进行鉴定，同时可利用与此His?Tag特异性结合的亲和纯化树脂对融合蛋白进行分纯化。此外，由于His?Tag与Ni2+柱的结合不依赖于其三级结构，因此蛋白可在变性条件下纯化。在强变性条件下细胞、包涵体、His?Tag可彻底溶解，而且His?Tag序列充分暴露，与Ni2+柱的结合更为紧密，减少杂蛋白的非特异性结合，因此能获得更高的纯化效率。

参考文献(References)

[1]DeborahA.Bradley&MahaHussain&CoraN.Anewerainprostatecancertherapy:newtargetsandnoveltherapeutics[J].TargOnc.2008,3:31–39

[2]KimC,YangH,FukushimaY,etal.VascularRhoJIsanEffectiveandSelectiveTargetforTumorAngiogenesisandVascularDisruption[J].CancerCell.2014,25(1):102-17

[3]JomainJB,TalletE,BroutinI,etal.StructuralandthermodynamicbasesforthedesignofpureprolactinreceptorantagonistsX-raystructureofDel1-9-G129R-hPRL[J].BiolChem,2007,282(45):33118-3313

[4]GoffinV,BernichteinS,TouraineP,etal.Developmentandpotentialclinicalusesofhumanprolactinreceptorantagonists[J].EndocrRev,2005,26(3):400-22

[5]LloveraM,PichardC,BernichteinS,etal.Humanprolactin(hPRL)antagonistsinhibithPRL-activatedsignalingpathwaysinvolvedinbreastcancercellproliferation[J].Oncogene.2000,19(41):4695-705

[6]HowellSJ,AndersonE,HunterT,etal.Prolactinreceptorantagonismreducestheclonogeniccapacityofbreastcancercellsandpotentiatesdoxorubicinandpaclitaxelcytotoxicity[J].BreastCancerRes,2008,10(4):R68

[7]DingsRP,NesmelovaI,GriffioenAW,etal.Discoveryanddevelopmentofanti-angiogenicpeptides:Astructurallink[J].Angiogenesis,2003,6(2):83-91

[8]SudhakarA,BoosaniCS.Inhibitionoftumorangiogenesisbytumstatin:insightsintosignalingmechanismsandimplicationsincancerregression[J].PharmRes.2008,25(12):2731-9

[9]omblynS,SpringsAE,LangenheimJF,etal.Combinationtherapyusingthreenovelprolactinreceptorantagonist-basedfusionproteinseffectivelyinhibitstumorrecurrenceandmetastasisinHER2/neutransgenicmice[J].IntJOncol,2009,34(4):1139-46

[10]ScottiML,LangenheimJF,TomblynS,etal.Additiveeffectsofaprolactinreceptorantagonist,G129R,andherceptinoninhibitionofHER2-overexpressingbreastcancercells[J].BreastCancerResTreat,2008,111(2):241–250

[11]BeckMT,ChenNY,FranekKJ,etal.Prolactinantagonist-endostatinfusionproteinasatargeteddual-functionaltherapeuticagentforbreastcancer[J].CancerRes,2003,63(13):3598-3604

[12]MaeshimaY,ManfrediM,ReimerC,etal.Identificationoftheanti-angiogenesissitewithinvascularbasementmembrane-derivedtumstatin[J].BiolChem,2001,276(18):15240-8

[13]MaeshimaY,SudhakarA,LivelyJC,etal.Tumstatin,anendothelialcell-specificinhibitorofproteinsynthesis[J].Science,2002,295(5552):140-143

[14]MaeshimaY,YerramallaUL,DhanabalM,etal.Extracellularmatrixderivedpeptidebindstoalpha(v)beta(3)integrinandinhibitsangiogenesis[J].BiolChem,2001,276(34):31959-31968