ELISA定量检测新生牛血清中乙脑抗体方法的初步验证

ELISA定量检测新生牛血清中乙脑抗体方法的初步验证

姚亮钱浩洲张景海

姚亮钱浩洲张景海

（沈阳药科大学辽宁沈阳10163）

【摘要】目的：对定量检测新生牛血清中乙脑抗体的ELISA方法进行初步验证。方法：对ELISA方法的灵敏度、精密性、特异性、线性和在新生牛血清中的适用性进行验证。结果：该法的灵敏度为1:4096；板内和板间CV平均值分别为1.2%和2.0%；抑制率均>79%；线性较好，相关系数r均>0.993;在新生牛血清中的检测回收率均>90%。结论：该法具有较高的灵敏度、精密性、特异性和线性，适用于检测新生牛血清中的乙脑抗体。

【关键词】乙脑抗体；ELISA；新生牛血清

【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）10-0152-02

PrimaryvalidationofquantitativeELISAforJapaneseencephalitisantibodyinnewbornbovineserumYaoLiangQianHaozhouZhangJinghai.ShenyangPharmaceuticalUniversity10163,China

【Abstract】ObjectiveToValidatethequantitativeELISAforantibodyagainstJapaneseEncephalitisVirus(JEV)innewbornbovineserum.MethodsThemethodwasverifiedforsensitivity,precision,specificity,linearityanddeterminedforAntibodyagainstJEVinnewbornbovineserum.ResultsThesensitivityofthemethodwas1:4096;ThemeanCVsofdeterminationresultsoftestsamplesinvariouswellsandonvariousplateswere1.2%and2.0%respectively;Allinhibitionsratiowere>79%;Thelinearitywasgood,allcorrelationcoefficientsrwere>0.993;Everyrecoverywas>90%innewbornbovineserum.ConclusionThemethodfordetectionofantibodyagainstJapaneseEncephalitisVirus(JEV)innewbornbovineserumwasapplicative,whichshowedhighsensitivity,precision,specificityandlinear.

【Keywords】Japaneseencephalitisantibody;ELISA;Newbornbovineserum

新生牛血清是乙脑疫苗生产中重要的原辅料，新生牛血清中如含有乙脑抗体将影响乙脑疫苗的正常生产。《中国药典》中检测新生牛血清原辅料中乙脑抗体的方法为蚀斑减少中和试验法，但该法检测时间长、操作步骤复杂、检验量受限。ELISA法检测新生牛血清中乙脑抗体的商品化试剂盒已经出现，如能采用ELISA法检测新生牛血清中乙脑抗体，将提高检测速度和效率，为证实ELISA法检测新生牛血清中乙脑抗体的可靠性，本文特做此验证。

1.材料与方法

1.1主要试剂

抗原：乙型脑炎灭活疫苗（作为乙脑抗原使用）；抗体：牛乙型脑炎病毒阳性血清

标记物：酶标羊抗牛IgG；测试样品：来自5个厂家各2批的新生牛血清，并已经蚀斑减少中和试验法检测为乙脑抗体为阴性。

1.2主要材料

96孔酶标板；封口膜。

1.3主要仪器

单道移液器（1～10?L）；单道移液器（50～200?L）；多道移液器（50～200?L）；漩涡混旋仪；计时器；酶标仪450nm。

1.4方法的验证

1.4.1灵敏度验证将牛乙型脑炎病毒阳性血清从1:128倍开始作2倍倍比稀释，ELISA方法检测乙脑抗体（A450值），同时检测阴性血清（A450值），将P/N≥2.1的最大血清稀释度作为检测的灵敏度。

1.4.2精密性验证用乙脑抗原包被96孔酶标板，第一板连续包被30孔，第二板和第三板各连续包被10孔，对同一血清样本重复测定50次，检测A450值，计算板内及板间变异系数，验证方法的精密性。

1.4.3特异性验证用过量的乙型脑炎灭活疫苗作为乙脑抗原中和不同浓度的牛乙脑阳性血清9份，用建立的ELISA方法在同一条件下检测牛乙脑阳性血清和中和后的牛乙脑阳性血清A450值，计算抑制率。

1.4.4线性验证将合适浓度的牛乙脑阳性血清梯度稀释，按照建立的ELISA方法，检测A450值，作出回归方程、相关系数和线性图。

1.4.5该法在新生牛血清中检测乙脑抗体的适用性将牛乙脑阳性血清分别加入五个厂家各两批的阴性新生牛血清中测定回收率，以评价ELISA方法检测新生牛血清中乙脑抗体的适用性。

2.结果

2.1灵敏度P/N值≥2.1的最大牛乙脑阳性血清稀释度为1:4096，表明该方法的灵敏度为1:4096。

表1灵敏度试验

2.2精密性板内CV平均值为1.2%，板间CV平均值为2.0%，CV值均低于10%,见表2.表明该方法精密性良好。

表2精密性验证结果（n=10）

2.4牛乙脑阳性血清梯度浓度与A450值的回归方程、相关系数r均>0.993见表4，线性图见图1。

表4牛乙脑阳性血清抗体定量ELISA回归方程、相关系数

图1牛乙脑阳性血清抗体定量ELISA线性图

2.5该法在新生牛血清中检测乙脑抗体的适用性回收率均>90%，表明该方法适用于检测新生牛血清中的乙脑抗体。

表5牛乙脑阳性血清在阴性新生牛血清中测定的回收率

3.讨论

ELISA反应本身是抗体与抗原的特异结合，具有反应的特异性，其配套使用的96孔微量滴定板能一次通过酶标仪比色，具有高通量、高效率的特点。本实验利用乙型脑炎灭活疫苗作为乙脑抗原，牛乙型脑炎病毒阳性血清作为抗体，尝试将ELISA方法应用于新生牛血清中乙脑抗体的检测，希望在保证准确性的前提下能够快速大量地检测样品，以突破通常采用的蚀斑减少中和试验法速度慢、样品量少的限制。在本验证中通过对牛乙脑抗体定量ELISA检测方法进行灵敏度、特异性、精密度、线性的初步验证基础上，进行了不同厂家不同批号的新生牛血清干扰性检测，结果表明，该法本身和该法在新生牛血清中的应用均达到可接受标准，在快速评价新生牛血清中的乙脑抗体水平时有一定作用。

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