羟基红黄色素A对肺成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响

羟基红黄色素A对肺成纤维细胞TGF-β1mRNA表达的影响

何小鹏1李敏马玉娟刘小伟党焱原淑莉

何小鹏1李敏马玉娟刘小伟党焱原淑莉

（咸阳市中心医院呼吸与危重症医学科712000）

【摘要】目的：研究羟基红花黄色素A（HSYA）对肺纤维化大鼠成纤维细胞中转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响。方法：取出生2天的SD大鼠肺组织做原代，使用差时贴壁法纯化肺成纤维细胞（LF），传至第三代到第五代时，当细胞密度达70%~80%，采用RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达。结果：RT-PCR检测TGF-β1mRNA在肺成纤维细胞中经HSYA作用后的表达,使用RT-PCR技术分别对空白对照组、HSYA组TGF-β1mRNA表达进行分析，结果表明经过HSYA作用后可促使肺成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞，加入HSYA后肺成纤维细胞中的TGF-β1mRNA表达量下降（P<0.05）。结论：通过与对照组对比，HSYA作用后可促使肺成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞，并且能够促使肺成纤维细胞中的TGF-β1mRNA表达量下降。结论HSYA可能通过降低TGF-β1含量，达到治疗肺纤维化的目的。

【关键字】羟基红花黄色素A；肺纤维化；成纤维细胞；TGF-β1

【中图分类号】R378199+6【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）8-0444-01

EffectofAontheexpressionofTGF-β1mRNAinpulmonaryfibroblasts

HeXiaopeng;Limin;MaYujuan;LiuXiaowei;DangYan;YuanShuli

(XianyangCenterHospitalforrespiratoryandcriticalcaremedicine71200)

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofhydroxysaffloweryellowA(HSYA)ontransforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)infibroblastsofratswithpulmonaryfibrosis.Methodstakebirth2daysSDratslungtissueasprimary,usingadifferentialstickingwallmethodpurifypulmonaryfibroblasts(LF),transmittedtothethirdgenerationtothefifthgeneration,whenthecelldensityreached70%-80%byRT-PCRdetectionofTGF-β1mRNAexpression.ResultstheexpressionofTGF-β1mRNAinlungfibroblastswasdetectedbyRT-PCR.TheexpressionofTGF-1mRNAinthecontrolgroupandHSYAgroupwereanalyzedbyRT-PCRtechnique.TheresultsshowedthattheTGF-β1expressionofP<0.05(TGF-β1mRNA)wasdecreasedbyHSYAafterHSYA.Conclusionbycomparingwiththecontrolgroup,HSYAcanpromotetheoccurrenceofpulmonaryfibroblastsandtheexpressionofTGF-β1mRNAinlungfibroblasts.ConclusionHSYAmayachievethegoaloftreatingpulmonaryfibrosisbyreducingthecontentofTGF-β1.

【Keywords】hydroxysaffloweryellowA;pulmonaryfibrosis;fibroblast;TGF-β1

肺纤维化(Pulmonaryfibrosis，PF)是一种发病隐匿、渐进性加重、病死率较高的肺部疾病，其发病率呈逐年上升趋势，目前确切病因和发病机制不清。传统疗法常以糖皮质激素，免疫制剂及细胞毒性药物为主导，但大多数患者治疗效果欠佳，且存在严重副作用。大量研究表明早期PF是可逆性病变，因此，阻断、延缓或逆转早期PF是治疗PF的一个重要方法。羟基红黄黄色素A（hydroxysaffloryellowA,HSYA）是从红花中提取的水溶性单体成分，是红花发挥活血化瘀的主要成分，能抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集。已有较多报道指出[1,2]，HSYA具有抗心肌损伤及抗氧化作用，但对于HSYA是否能够干预和治疗PF研究鲜有报道。本研究通过观察HSYA对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物与主要试剂出生2d的SD大鼠3只；DMEM培养基；胎牛血清；胰蛋白酶；Trizol、PCR引物；PCR试剂盒。

1.2实验分组与方法

取出生2天的SD大鼠肺组织做原代，使用差时贴壁法纯化肺成纤维细胞（LF），传至第三代到第五代时，当细胞密度达70%~80%，换含0.5%胎牛血清的DMEM培养基同步24小时，后随机分为三组，第一组为空白对照组，第二组为HSYA组，第三组为激素组，一天后收集各组细胞及细胞上清液。

1.3RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达

取适量的培养细胞（细胞密度达70%~80%）加入1mlTrizol进行裂解，按RNAisoPlusTotalRNA提取试剂说明书提前总RNA，并用核酸蛋白分析仪检测RNA浓度，按照PrimeScriptRTreagentKit说明合成cRNA。PCR的引物序列：TGF-β1上游引物5'-CAAGGTGAAACGGCAAGGAA-3'，下游引物5'-GTTCCAGACAAGAGGAGTGA-3'。反应条件：94℃起始变性3min，94℃变性30s，退火30s（TGF-β1退火温度51.0℃），72℃延伸60s，TGF-β1循环32次。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统和GelPro4.0软件进行图像分析。以TGF-β1作为内参照，计算TGF-β1与内参的灰度比值表示其mRNA相对表达量。

1.4统计学分析

采用SPASS13.0统计软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示。两两比较用t检验，P<0.05为具有统计学意义。

2实验结果

RT-PCR检测TGF-β1mRNA在肺成纤维细胞中经HSYA作用后的表达,使用RT-PCR技术分别对空白对照组、HSYA组TGF-β1mRNA表达进行分析，结果表明经过HSYA作用后可促使肺成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞，加入HSYA后肺成纤维细胞中的TGF-β1mRNA表达量下降（P<0.05）（图1)

1.对照组;2.HSYA治疗组；

3讨论

肺纤维化是组织损伤后的过度修复造成肺部纤维化的重要原因，涉及到气道、肺间质和肺实质的多种疾病，尽管各疾病病理及临床特点不尽相同，但是在致病机制中均涉及到肺损伤后的修复反应。TGF-β1作为结缔组织损伤修复过程中强力的刺激信号，可通过多种机制刺激肺纤维化的进程，有报道显示，其可通过刺激HSC活化并诱导过量新胶原而促进肝纤维化进程，肺纤维化同样与改机制有关[3]。TGF-β1通过刺激各种细胞外基质成分的合成，促进基质蛋白上调及受体的产生，同时减少机制降解酶，以增加降解酶抑制剂的合成，同时其还可抑制蛋白水解酶的产生，使细胞外基质进一步增加。因此通过降低TGF-β1水平来实现肺间质纤维化的治疗[4]。

红花是一味传统的活血化瘀中药，在《本草图经》中即有红花用药的记载，羟基红花黄色素A（HSYA）的相关研究在近年颇受关注，HSYA是从红花中提取，同样具有活血化瘀的功效，能够抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集。奚胜燕[5]等通过建立裸鼠肿瘤模型，给予不同剂量的HSYA后发现，HAYA能够促进肿瘤凋亡，从而抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长，具有抗肿瘤作用。金鸣[6]等使用HAYA直接作用于肝损伤而发生脂质过氧化的小鼠离体肝组织，发现其过氧化损伤明显减轻，王艺蓉[7]等通过研究发现，HSYA对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达有很好抑制作用，对肝纤维化具有一定治疗效果。本研究通过与对照组对比，HSYA作用后可促使肺成纤维细胞发生表型转化为肌成纤维细胞，并且能够促使肺成纤维细胞中的TGF-β1mRNA表达量下降，从而达到治疗PF的目的。

本研究结果显示，中药羟基红黄色素A能够通过降低TGF-β1含量，从而有效抑制肺纤维化，而具体作用机制仍需要进一步探讨。

参考文献：

[1]金鸣,董宁宁,吴伟等.轻基红花黄色素A缓解大鼠心肌细胞调亡作用的研究[J].中草药,2009,40(06):924-930.

[2].刘伊娜,朱健华,吴翔等.轻基红花黄色素A对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制的探讨[J].交通医学,2009,23(5):482-487.

[3]赵文丽,姜庆久,吴影.红花对实验性大鼠肝纤维化的抑制作用.黑龙江医药科学,2004;27(4):4-5.

[4]柴文戍，李摇颖，张海林，等。灯盏花素对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1及透明质酸含量的影响.中国药理学通报，2010,26（10）：1613-1616.

[5]奚胜艳,张前,刘朝阳等.经基红花黄色素A对人胃癌移植瘤裸鼠瘤组织bFGF蛋白及MMP-9表达的影响[J].中国中药杂志,2010,35(21):2877-2880.

[6].金鸣,董宁宁,吴伟等.轻基红花黄色素A缓解大鼠心肌细胞调亡作用的研究[J].中草药,2009,40(06):924-930.

[7]王艺蓉,白咸勇,李京敏,胥新芸,王继超,李雅娜.羟基红花黄色素A对肝纤维化大鼠肝组织TGF-P1表达的影响.滨州医学院学报2010，33(6):405-408。

作者简介：

何小鹏，主任医师，主要从事呼吸系统重症感染及肺纤维化的研究。