p33ING1b蛋白在急性髓细胞白血病中的表达及意义

p33ING1b蛋白在急性髓细胞白血病中的表达及意义

杨黑女李栋王炳华

杨黑女李栋王炳华（威海市文登中心医院血液科山东威海264400）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2010）36-0151-02

【摘要】目的检测p33ING1b蛋白在急性髓细胞白血病中的表达情况，为进一步探索急性髓细胞白血病的发病机制、临床诊治提供依据。方法以32例急性髓细胞白血病骨髓细胞为研究对象，以10例正常人为对照，采用免疫细胞化学S-P法检测p33ING1b蛋白在骨髓细胞核和细胞浆中的表达水平及其相关性。结果p33ING1b蛋白主要定位于细胞核内，急性髓细胞白血病组p33ING1b蛋白的核表达低于正常组，但无统计学差异，p33ING1b蛋白核表达与浆表达呈负相关。结论AML患者体内p33ING1b蛋白的表达和定位无明显异常，p33ING1b基因结构和功能异常不是AML细胞癌变的重要原因。

【关键词】急性髓细胞性白血病（AML）p33ING1b

ING1是一种新型抑癌基因，其中，p33ING1b是主要的表达蛋白[1，2]。p33ING1b与急性淋巴细胞白血病、胃癌、肠癌等恶性肿瘤的发生、发展有关，但其异常是否参与了急性髓细胞白血病（AML）的演进，目前尚不清楚。

1对象与方法

1.1研究对象AML组（病例组）：32例，为2007年1月-2010年9月收治于文登中心医院血液科经骨髓细胞学和免疫学检查确诊为AML的患者，其中男性18例，女性14例，年龄10-68岁，平均年龄45.2±15.5岁。正常对照组：10例，系骨髓象正常的非血液系统患者。

1.2仪器与试剂离心机（Eppendorf公司，German）；Ficoll淋巴细胞分离液（中国医学科学院血液学研究所）；抗p33ING1b多克隆抗体，N-19，羊抗人（SantaCruz公司，美国）；超敏S-P（鼠、羊）试剂盒（福州迈新公司KIT9701、9709，中国）。

1.3免疫细胞化学S-P法检测p33ING1b蛋白的表达：①标本制备：取患者EDTA抗凝的骨髓2-3ml，等量PBS稀释，Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，制成2-8×106/ml的细胞悬液，涂于APES处理过的载玻片上，沉淀10分钟后吸去上清液，加入适量的10%甲醛-丙酮磷酸盐缓冲液固定10分钟，待涂片略干后，PBS洗3次，自然晾干，-70℃冰箱保存备用。②检测p33ING1b蛋白的表达：从冰箱内取出玻片标本，自然干燥，PBS洗5分钟，3%H2O2室温孵育10分钟，柠檬酸缓冲液微波抗原修复10分钟，10%非免疫动物血清室温孵育10分钟，随后加入p33ING1b（1∶500稀释液）一抗，4℃过夜，接着加入生物素标记的相应二抗，37℃孵育30分钟，最后加入辣根过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白工作液，37℃孵育20分钟，所有孵育过程均在湿盒内进行，每一步骤后均用PBS洗3次，每次5分钟，DAB显色10分钟，自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。每批实验均设阳性，阴性及空白对照。p33ING1b以K562细胞株作为阳性对照，p33ING1b以阴性标本作为阴性对照。③结果判定：胞核或胞浆其中之一有棕黄色颗粒者即视为阳性细胞，但分别计数。油镜下计数500个白血病细胞，计算p33ING1b蛋白的阳性细胞百分数。

1.4统计学处理采用SPSS软件包，均数比较采用t检验，相关分析采用Pearson。

2结果

p33ING1b蛋白主要见于正常人和AML患者骨髓单个核细胞的核内。AML患者p33ING1b蛋白的核表达虽低于正常组，但与正常组相比无统计学意义（P>0.05）。p33ING1b蛋白在AML患者细胞核内表达的下降常伴随胞浆中表达的上升，p33ING1b蛋白核表达与浆表达呈负相关（n=32，r=-0.318，P=0.040）。

3讨论

p33ING1b蛋白主要位于人类大多数组织的细胞核内，为p53蛋白反应家族成员，它能增强野生型p53（wtp53）抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用，其机制可能是通过与癌蛋白MDM-2竞争性结合wtp53，进而稳定和激活p53。它调节p53的功能依赖于其核定位，从核内转移到核外意味着其活性的丧失。

本研究发现AML患者骨髓细胞中p33ING1b蛋白核表达的下降常伴随着浆表达的上升，两者具有负相关性，提示p33ING1b蛋白从核内移到核外可能是其功能失活的一种方式。

本研究发现有意思的是，p33ING1b在骨髓和外周血成熟粒细胞核中不表达或低表达，提示该蛋白可能与p18INK4c、p19INK4d一样，在造血细胞中的表达具有阶段性，起调节细胞增殖、分化作用，有待进一步研究。

参考文献

[1]GarkaravtsevI,DemetrickD,RiabowolK.Cellularlocalizationandchromosomemappingofanovelcandiatetumorsuppressorgene(ING1).CytogenetCellGenet,1997,76:176-178.

[2]SaitoA,FurukawaT,FukushigeS,etal.p24/ING1-ALT1andp47/ING1-ALT2,distinctalterativetranscriptsofp33/ING1.JHumGenet,2000,45:177-181.