RSV感染小鼠后肺组织的病理变化

RSV感染小鼠后肺组织的病理变化

宋文秀1宋晓慧2范勇波1

宋文秀1宋晓慧2范勇波1

(1.广东省珠海市斗门区遵义医学院第五附属医院儿科519100；2.广东省珠海市遵义医学院珠海校区研究生519100)【摘要】目的：观察RSV(呼吸道合胞病毒)感染小鼠后肺组织的气道炎症及胶原沉积的分级。方法：48只RSV感染Balb/c小鼠分别予感染后当天、3天、7天、14天，采用HE及VG染色观察气道外周炎症分级和气道胶原沉积分级。结果：1、RSV感染组气道炎症分级显著高于对照组(P<0.05)；RSV感染组在感染第7天时气道炎症分级达最高峰，在感染第14天时，气道炎症分级下降(P<0.05)。2、RSV感染组和对照组在当天至第7天未见明显胶原沉积，无显著性差异(P>0.05)；在感染第14天时，气道外周可见明显胶原沉积(P<0.05)。结论：RSV感染Balb/c小鼠后气道的炎症至少持续至感染后14天；在感染14天时气道外周可见明显的胶原沉积。

【关键词】RSV；Balb/c小鼠；气道炎症；胶原沉积；【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】2095-7165(2015)16-0239-01

RSV是婴幼儿时期最为重要的呼吸道感染病毒之一[1]。诱发婴幼儿喘息第一次发作和导致婴幼儿住院治疗的最常见的原因也是RSV的下呼吸道感染，部分患儿感染RSV毛细支气管炎后，临床上会出现反复咳喘，这是否和RSV对肺组织的持续性病理改变有关？查阅文献未见相关报道，鉴于在临床上对病人进行反复的病理检查不现实，本研究特制作RSV感染小鼠的模型，动态观察肺组织的气道炎症及胶原沉积的分级。

1实验方法1.1动物模型的建立参考文献[2]制备RSV感染小鼠模型。48只雌性Balb/c小鼠，体重15-20g，随机将小鼠分为对照组和RSV感染组，每组24只。RSV感染组小鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，达到一定的麻醉深度时，经鼻腔滴入100ul106PFU的RSV；对照组小鼠麻醉后，经鼻腔滴入相同剂量的生理盐水，滴鼻感染后，密切观察小鼠一般情况。分别于滴鼻后当天、3天、7天、14天(每个时间点对照组和RSV感染组各6只)颈椎脱臼处死小鼠取材。

1.2取材及病理学观察打开处死的小鼠胸腔，切下左肺放入4%中性甲醛中固定24小时后取出，沿支气管走向朝肺门方向切开取小块肺组织，脱水，石蜡包埋，切片行HE染色和VG染色，并在光镜下观察气道外周炎性细胞浸润情况以及气道外周胶原纤维沉积情况。气道外周炎症分级[3]及气道外周胶原沉积分级参考文献的分级[4]。

1.3统计学方法采用SPSS16.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。

气道炎症分级及气道胶原沉积分级资料采用非参数检验。

2结果2.1RSV感染组和对照组各时间点气道炎症的严重程度对照组肺泡结构清晰完整，无炎性细胞浸润；RSV感染组肺泡壁、肺泡间隔充血，水肿，增厚，部分肺泡壁断裂融合，肺泡腔扩大，各时间点气道外周及周围血管均有不同程度的炎性细胞浸润，在RSV感染第7天，炎性细胞浸润最明显，部分炎症细胞渗入支气管腔内(见图1)。

差异(P>0.05)；在第14天时，RSV感染组气道外周胶原沉积分级高于对照组(P<0.05)；3讨论RSV是引起下呼吸道感染的重要病原之一，婴幼儿时期的RSV下呼吸道感染，无论是特应性体质儿童还是非特应性体质儿童，其哮喘发生的危险性均较普通儿童明显增高，是哮喘发生的独立危险因素[5]，且喘息性患儿感染RSV的概率较高[6]。

RSV感染的动物模型较多，灵长类动物中的黑猩猩是RSV感染动物模型的最佳选择，但因其特殊性不能常规应用于动物实验。实验室中小鼠是最常使用动物之一。研究发现雌性小鼠比雄性小鼠能产生更明显的气道炎症[7]。RSV的自然感染宿主不是小鼠，感染后无明显临床表现，但RSV感染小鼠后肺组织病理学改变较明显。根据小鼠的生长周期，8周之前的小鼠均为未成熟小鼠，且本实验需观察至RSV感染14天，因此本实验所选取的实验动物是4-6周龄，体重15-20g，雌性Balb/c幼鼠。本实验在RSV感染组小鼠中也发现，RSV滴鼻感染小鼠后临床表现也不明显，部分小鼠出现毛乱，活动度降低，呼吸增快的表现。本实验给小鼠经鼻腔滴入106PFU的RSV，每只滴入100ul，在不同的时间点处死小鼠并取材，研究发现，对照组各个时间点小鼠肺组织病理切片HE染色未见明显炎性细胞浸润，且肺组织结构比较清晰。

RSV感染组当天、3天、7天及14天时间点小鼠肺组织较相应对照组均有炎性细胞浸润，结果显示在感染当天时，肺组织即有炎性细胞浸润，且炎性细胞浸润程度进行性加重，至第7天时，RSV感染小鼠肺组织呈明显的炎症改变，大量淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等在气道和血管周围间质成套状浸润，肺泡壁充血、水肿，明显增厚，肺泡腔狭窄，部分肺泡壁断裂融合，肺泡腔扩大，且该时间点炎症反应最为明显。RSV感染小鼠肺组织炎症至14天时仍持续存在，但与第7天相比，炎症反应减轻。本实验观察到RSV感染小鼠后肺部的炎症病理改变一直持续到14天，提示临床医生对RSV感染的下呼吸道患儿进行抗炎治疗的时间要长，以减少持续的炎症刺激对气道的损伤。

由于本实验只观察到感染后14天，肺部的炎症改变具体持续的时间需以后继续研究。

气道重塑是支气管哮喘的重要病理特征之一。目前对气道重塑的定义主要以病理学特征为主，细胞外基质(ECM)的沉积、平滑肌肥大、上皮的脱落和增生、杯状细胞的增多及粘膜下腺体的增生、平滑肌细胞聚集增多、微血管生成、气道软骨减少等是气道重塑的主要病理改变[8]。既往认为，气道重塑发生在疾病的后期，但Sigurs等[10]采用前瞻性研究对早期患过RSV下呼吸道感染的47名婴幼儿进行研究，推测RSV下呼吸道感染可能启动了气道重塑的发生，并且Malmstrom等[9]发现3岁之前的反复RSV下呼吸道感染的患儿即存在肺功能的下降、网状基底膜的增厚及肥大细胞的增多。ECM的沉积是气道重塑特征性病理改变[10]，特别是Ⅰ型及Ⅲ型胶原的沉积，胶原沉积可发生在气道固有层、肺泡间隔及肺间质。本实验发现，在对照组小鼠及RSV感染组小鼠的当天、第3天及第7天均未见明显的胶原沉积情况，而在RSV感染组小鼠的第14天，肺组织VG染色显示气道外周、肺泡间隔及血管外周均可见胶原沉积情况，并对气道外周胶原的沉积进行分级，发现，对照组小鼠气道胶原沉积分级无显著性差异，RSV感染组小鼠有显著性差异，RSV感染组不同时间点的统计学结果显示，RSV感染当天、3天、7天之间比较无显著性差异，而RSV感染14天与当天、3天及7天比较均有显著性差异，提示，在RSV感染小鼠第14天时已发生胶原沉积。

综上所述，本实验通过动物实验发现，RSV感染小鼠对肺组织的病理损害可持续至感染后14天，且在感染后14天时已发生胶原沉积。

参考文献[1]EverardML.Theroleoftherespiratorysyncytialvirusinairwaysyndromesinchildhood[J]．CurrAllergyAsthmaRep,2006,6(2)：97-102.[2]廉国利，俞海国，赵晓东，杨锡强.小鼠呼吸道合胞病毒感染模型的建立[M].西安交通大学学报(医学版)，2003，24(4)：329-332.[3]ChoJY,MillerM,BaekKJ,CastanedaD,etal.ImmunostimulatoryDNAsequencesinhibitrespiratorysyncytialviralload,airwayinflammation，andmucussecretion．JAllergyClinImmunol,2001,108(5):697-702.[4]KenyonNJ,WardRD,LastJA．Airwayfibrosisinamousemodelofairwayinflammation．ToxicolApplPharmacol,2003,186(2):90-100.[5]SigursN,GustafssonPM,BjarnasonR,etal.Severerespiratorysyncytialvirusbronchiolitisininfancyandasthmaandallergyatage13.AmJRespirCritCareMed.2005,171(2):137-41.[6]钱月芳，高兰平，汤华平等.呼吸道合胞病毒与婴幼儿早期喘息的相关性[M].临床肺科杂志,2013，18(2)：284-285.[7]HayashiT,AdachiY,HasegawaK,etal.LesssensitivityforairwayinflammationinmalesthanfemalesinBALB/cmice.ScandJImmunol,2003,57(6):562-7.[8]BergeronC,BouletLP.Stucturalchangesinairwaydiseases:characteristics,mechanisms,consequences,andpharmacologicmodulation[J].Chest,2006,129(4):1068-87.[9]MalmstromK,PelkonenAS,MalmbergLP,etal.Lungfunction,airwayremodelingandinflammationinsymptomaticinfants:outcomeat3years[J].Thorax,2011,66(2):157-162.[10]TagayaE,TamaokiJ.MechanismsofAirwayRemodelinginAsthma.AllergolInt,2007,56(4):331-40.