小肠结肠炎耶尔森菌感染腹泻的实验室诊断研究

小肠结肠炎耶尔森菌感染腹泻的实验室诊断研究

李铭新

李铭新（辽宁省沈阳市苏家屯区疾病预防控制中心110101）

【关键词】小肠结肠炎耶尔森菌感染腹泻实验室诊断

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）43-0058-02

小肠结肠炎耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）是一种人畜共患病的病原菌，分布很广泛，近年来引起人们广泛关注。由于该菌能引起人类感染性腹泻，并且由它感染可引发后遗症，而逐渐受到全球重视。小肠结肠炎耶尔森菌是一种嗜冷菌，0～4℃仍可繁殖并产生毒素，引起急性胃肠炎型食物中毒，又称“冰箱病”，该菌引起的食物中毒近年来时有报道[1-3]。耶尔森菌病典型症状为胃肠炎症状、发热，亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。我国小肠结肠炎耶尔森菌的监测工作从2005年开始。由于医务人员普遍缺乏对本菌的认识，临床医生在对胃肠道腹泻病人进行诊断时往往忽略了此菌感染的可能性，检验人员也很少能为临床诊断提供准确的实验室检测结论。现就该菌的实验室检测方法进行分析总结。

1传统的分离培养方法

目前检测小肠结肠炎耶尔森菌的金标准仍为分离培养法。为了防止漏检，提高检出率，必须采用增菌的方法，以使受损伤的小肠结肠炎耶尔森菌得到较好的恢复和繁殖或从污染少量细菌的样品中检出。由于该菌能在0～4℃生长，采用4℃冷增菌，有利于小肠结肠炎耶尔森菌存活和缓慢繁殖，而对大多数其它细菌不利或保持不变，特别适用于含菌量少的被检材料，同时用改良磷酸盐缓冲液对本菌有一定的选择性，经冷增菌培养后，分别在7d、14d、21d时进行分离，可获得较好的检出效果，虽然增菌时间长，但可提高检出率。

由于小肠结肠炎耶尔森菌较其它革兰氏阴性细菌生长慢，其它细菌在弱选择性琼脂平板上，在22～26℃情况下仍可生长较快，而耶尔森菌往往会被掩盖。为控制其它细菌过多生长，采用耶尔森菌对弱碱性有较高抵抗力的特点，将其冷增菌后的样液，经弱碱液迅速处理15秒，立即接种选择性平板进行分离，此方法可杀死大部分不耐碱的其它细菌，可提高小肠结肠炎耶尔森菌的检出率。但是在碱处理过程中，必须严格掌握处理方法，不宜超过时间，以免影响检出效果。需要注意的是检验乳品时不需要进行碱处理，增菌培养后直接进行分离，尤其在细菌污染较少情况下的样品，经碱处理后反而会影响该菌的检出率。

小肠结肠炎耶尔森菌可以在大多数培养基上生长，使用选择性培养基仍然是最常用的方法。CIN培养基是Schiemann在1979年开发的，Head等人做了包括麦康凯培养基在内的几种选择性培养基分离小肠结肠炎耶尔森菌的对比实验，发现CIN琼脂是最有效的。CIN极大地抑制了杂菌，而小肠结肠炎耶尔森菌是明显的深红色中心，外周围绕半透明的区域（公牛眼）。红色色素沉着是发酵D-甘露醇的结果。但是CIN琼脂价格较高，不易在基层实验室推广使用。由于CIN选择琼脂配方中的Irgasan成分在我国不易购买，改用二苯醚代替，效果相同，此改良后的CIN称为“CIN-1”。

小肠结肠炎耶尔森菌生化反应一般在22～30℃下较为稳定。由于小肠结肠炎耶尔森菌的血清型别和生物型别较多，生化性状复杂不定，易受培养温度，时间等各种条件的影响，还与地理分布、菌株来源等也有着一定关系。为了避免对实验结果的影响，必须严格遵守试验要求。

根据小肠结肠炎耶尔森菌O抗原可分为50种以上血清型，但只有几种血清型与致病性有关。致病型别各地区不同，我国主要为O：9、O：8、O：5、O：3等。某些“O”抗原同其它细菌有共同性，如O：9与布鲁氏菌有交叉反应，0:12与沙门氏菌有交叉反应等，在流行病学调查中，血清学诊断起着较为重要的作用，但在区分致病性与非致病性上价值不大。

由于不同地区小肠结肠炎耶尔森菌致病菌株的血清型分布不同[4],且该菌血清型别较多，分离培养法虽然为小肠结肠炎耶尔森菌检验的国家标准方法，但是已不能满足快速检测。对于大批量样本的筛检，该方法成本高，人员操作费时、费力。急需建立一种新的方法快速准确检测小肠结肠炎耶尔森菌。

2PCR检测

小肠结肠炎耶尔森菌产生毒力的主要基因是粘附侵袭位点ail基因，失去ail的菌株毒力均下降，几乎在所有的腹泻病人中都能分离到携带ail的致病菌株［5］。因foxA和ail基因二者联合可以作为小肠结肠炎耶尔森菌检测的靶基因［6］，肖玉春等[7]报道，用foxA和ail基因联合的PCR检测法检测来源于生猪标本中的小肠结肠炎耶尔森菌，检出率明显高于分离培养法(P＜0.05).实验分别采用了ail和foxA基因联合PCR扩增方法与分离培养法检测生猪标本中小肠结肠炎耶尔森菌。结果700份标本中，小肠结肠炎耶尔森菌特异性基因PCR检测阳性402份，阳性率57.43%;小肠结肠炎耶尔森菌分离培养阳性278份，阳性率39.71%。在PCR检测阳性的402份标本中，分离小肠结肠炎耶尔森菌271株，分离阳性率为67.41%;PCR检测阴性的298份标本中，分离小肠结肠炎耶尔森菌7株，分离阳性率仅为2.35%。通过统计分析可知，针对小肠结肠炎耶尔森菌两种方法的检测结果存在显著差异。而基因联合的PCR检测方法明显比分离培养法检出率要高，虽然存在漏检的情况，但漏检率很低。能够分离培养出小肠结肠炎耶尔森菌的标本PCR结果显示绝大部分为阳性，而PCR结果阴性的标本已很难再分离出细菌。所以根据PCR检测结果可以很好的指导我们对大量标本进行菌株分离培养工作，使得我们能够对PCR结果阳性的标本进行重点接种培养，从而提高小肠结肠炎耶尔森菌的检出率。

PCR方法可快速准确地检测小肠结肠炎耶尔森菌，对于PCR方法来说，目前已得到了广泛的应用，虽然在应用过程中遇到设备及特异性等方面的限制，但PCR方法仍然是目前研究小肠结肠炎耶尔森菌的一个必不可少的方法，PCR检测首先要涉及到的就是靶基因的选择和引物的设计，国内外绝大多数研究者选择靶基因集中在小肠结肠炎耶尔森菌的毒力质粒上，如ail（黏附侵袭基因）、ystA(耐热性肠毒素A)、ystB（耐热性肠毒素B）、yadA（黏附素基因）、virF（毒力因子基因）等[8]。以毒力质粒作为靶基因序列进行检测，不仅可以证实小肠结肠炎耶尔森菌，同时还可以确认其是否具有毒力，但是因为小肠结肠炎耶尔森菌的毒力质粒很容易被丢失，并且这种丢失是不可逆的，所以可能会出现假阴性结果。

有研究指出[8],携带ystB的生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌非致病菌株在许多暴发腹泻病人中可以分离得到,说明非致病株也是潜在的危害因素，仍然具有危害性。张建等[9]利用小肠结肠炎耶尔森菌的ail毒力基因以及该菌属的保守序列16srRNA基因,设计针对致病性小肠结肠炎耶尔森菌的PCR引物,进行多重PCR扩增。并对退火温度、Mg2+浓度以及引物浓度等扩增条件进行优化，建立快速检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌的多重PCR方法。研究结果证实多重PCR用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌具有较高的特异性(100%)和敏感性(检测下限为102cfu/ml)。经过多次实验比较,得到PCR反应的最佳引物浓度为200nmol/L的Ail、100nmol/L的Yer，25mmol/L的Mg2+浓度,退火温度62℃。张建等[9]采用的该方法可以对致病菌株和非致病菌株同时进行检测,检测范围扩大,对致病菌株和非致病菌株的污染监测研究提供了平台。

3LAMP检测

LAMP技术是在65℃恒温条件下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。徐德顺等[10]建立的LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法快速、简便、特异性强、灵敏度高。罗敏红等[11]将检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的LAMP体系进行了优化，LAMP实际应用效果得到证实。LAMP技术要求的设备简单、操作方便、肉眼即可判断结果，且所需时间短、特异性好、灵敏度高，适合基层普及推广，因此受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，有望成为简便快速的常规检测手段。国外LAMP技术已广泛应用各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。

参考文献

[1]郑浩轩,姜泊．小肠结肠炎耶尔森菌研究概况[J]．中国微生态学杂志,2006,18(5):416-419．

[2]AckersML,SchoenfeldS,MarkmanJ,etal．AnoutbreakofYersiniaEnterocoliticaO:8infectionsassociatedwithpasteurizedmilk[J]?JInfectDis,2000,181:1834-1837．

[3]SusanMRay,ShamaDAhuja,PaulA,etal．Population-basedsurveillanceforYersiniaenterocoliticainfectionsinfoodnetsites,1996-1999:higherriskofdiseaseininfantsandminoritypopulations[J].JInfectDis,2004,38(Suppl3):S181-189．

[4]王鑫,景怀琦,徐建国．小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素家族及其编码基因研究进展[J]．中国媒介生物学及控制杂志,2006,17(4):340-344．

[5]陆承平，杨汉春，黄青云，等.动物微生物学[M].北京：中国农业出版社，2008.

[6]YingH，XinW，CuiZ，etal．PossibleuseofailandfoxApolymorphismsfordetectingpathogenicYersiniaenterocolitica［J］．BMCMicrobiol，2010，10:211．

[7]肖玉春,李可维,梁俊容，等．聚合酶链反应法和分离培养法筛检小肠结肠炎耶尔森菌方法的比较研究［J］.疾病监测，2013，28(6):456－458．

[8]王鑫,邱海燕,肖玉春,等．小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒B基因(ystB)初步研究[J]．中国人兽共患病杂志,2005,21(6):449-453．

[9]张健,杨华源,刘巧宜,等．多重PCR快速检测致病性小肠结肠炎耶尔森菌[J]．中国卫生检验杂志,2009,19(4):740-741，760．

[10]徐德顺,陈莉萍,王亮．小肠结肠炎耶尔森菌环介导等温扩增技术检测方法的建立[J]．中国预防医学杂志,2010,11(1):92-96．

[11]罗敏红,胡婷婷,冀新凤,等．建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中小肠结肠炎耶尔森菌[J]．热带医学杂志,2013,13(4):449-452，495．