羊水细胞培养染色体核型分析技术在产前诊断中的应用

羊水细胞培养染色体核型分析技术在产前诊断中的应用

钟伟明吴汉锋黄善忠

（贵港市妇幼保健院广西贵港537100）

摘要：1966年羊水细胞培养成功同时应用在胎儿染色体疾病的产前诊断当中，从那以后这项技术在产前诊断当中已经达到了无可替代的地位，但是传统的羊水细胞培养时间长、成功率低、不能够满足临床需要，因此人们对羊水细胞培养技术进行不断的摸索，得到了更大的改进，诞生了羊水细胞培养染色体核型分析技术。这项技术在产前诊断当中的作用和效果突出，体现出技术自身优势，因此本文主要对羊水细胞染色体核型分析技术在产前诊断当中的应用进行进一步的研究和探讨。

关键词：羊水细胞培养；染色体核型分析技术；产前诊断；应用

对于产前诊断工作来说，羊水细胞的培养和染色体的制备是非常重要的一个技术。在临床当中，羊水细胞的培养要求高、操作难度大、培养时间长、易污染、核型分裂少的问题，因此在很多医疗机构没有开展羊水产前诊断工作[1]。近二十年来羊水细胞的培养以及染色体制片技术都得到了明显的改进，但是从客观的角度来说，羊水细胞的培养和制片依然是难以攻克的难题[2]。基于这样的特点对羊水细胞培养体染色体核型分析技术在产前诊断当中的应用进行研究和探讨，能够明确这项技术的意义和关键点，从而也为技术的研发以及产前诊断工作的推广进行帮助。

一、产前诊断的背景和意义

产前诊断保障母婴健康，提高人口出生素质，达到优生优育目的。在这样的背景之下，结合我国的现状，明确产前实施优生健康检查在优生优育中的意义，能够在一定程度上推动我国优生优育工作的发展[3]。通过产前诊断，人口出生质量得到提高，最终能够在国力的综合提升当中发挥着积极的作用。我国每年新生儿出生缺陷率大约在5%，也就是说每年都会新增110万左右的先天性疾病儿童[4]。从新生儿健康的角度出发，进行产前诊断是一种比较有效的方式，能够对影响优生优育的疾病进行及时的发现及诊断，并且采取有效的措施，使得生育的质量得到一定程度上的提高[5]。

二、染色体核型分析

染色体核型分析是细胞遗传学研究得基本方法，是研究物种演化、分类及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段[6]。它可以诊断一些由于染色体异常所导致的遗传疾病，同时会以分裂中期的染色体作为具体的研究对象，根据染色体本身的长度和着丝点的位置，充分考虑长短臂的比例和随体的特征，利用现代技术对染色体开展进一步的分析，然后再进行相关的排序和编号，最终根据染色体结构和数目的变异进行诊断[7]。对于这种技术来说，它最主要的原理是利用了同物种之间的染色体，有着各自特定形态结构的特点，并且这样的一种形态特征，经过消化和染色处理后，通过显微镜可以看到清晰和直观的染色体形态结构，在和正常的和行进行对比之下找到相关的差异性，进一步确定染色体数目异常和结构异常[8]。染色体核型分析技术能够充分根据染色体的结构和数目的变异状况，为染色体疾病的诊断提供充分的依据，最为典型的就是21三体综合征的诊断。除此之外，在医学研究领域当中也有很多学者尝试联合荧光原位杂交技术，对基因开展进一步的定位操作[9]。

三、羊水细胞培养染色体核型分析技术

羊水细胞培养染色体核型分析技术可以有效的诊断胎儿是否存在着染色体异常，判断先天愚型、13-三体、18-三体、先天性睾丸发育不全、罗伯逊易位、特纳综合征等染色体疾病。利用培养之后的羊水细胞进行生化分析，能够诊断先天性代谢疾病；同时测定羊水甲胎蛋白含量，进一步诊断胎儿是否存在着开放性神经管畸形的情况[10]。如果在检测的过程当中发现羊水里面甲胎蛋白的值几乎上升到10倍以上的时候，那么可以诊断为无脑儿或者存在着脊柱裂的现象。甲胎蛋白值对于胎儿的胎龄，Rh血型不合和其它的畸形等都是有着比较明显的诊断帮助性作用的，通过羊水细胞性染色质的测定工作能够充分了解胎儿的性别，也进一步诊断胎儿是否存在着遗传性疾病的状况[11]。例如遇到一些母亲是某种伴性遗传性致病基因的携带者，那么它也是男孩的时候发病的危险概率就会比较高，达到50%左右，此时就应该选择终止妊娠，但是如果是女孩就可以保留[12]。

四、羊水细胞培养染色体核型分析技术在产前诊断中的应用

近些年来随着人们对于染色体疾病带来危害的认识在不断的提高，同时在优生优育高度重视的背景之下，在产前对一些遗传疾病和先天性的疾病开展，早期的发现与诊断工作已经成为了全人类共同关注的一个话题[13]。特别是在我国全面二孩政策开放，找到有效的医学手段和措施，尽早发现遗传疾病和先天性疾病，有利于提高我国人口出生素质[14]。随着科学技术和医疗水平的不断提升，遗传疾病和先天性疾病的早期诊断和治疗一直都在不断的寻找更好的方法，目前基于芯片和测序水平上的各类技术已经应用于实验室诊断。但是结合分子遗传学和细胞遗传学的优缺点，羊水细胞培养的染色体核型分析仍然是产前诊断主要的手段之一，是产前诊断技术的金标准[15]。

1、操作方法

在开展相关操作的过程当中，遵循知情同意原则，告知孕妇有可能存在的手术风险，签署知情同意书。在B超引导下进行羊膜腔穿刺术，经过孕妇的皮肤缓慢的进入到羊膜腔当中，先抽取2ml的羊水弃去，防止母体污染母体血，然后再抽取20ml羊水，分别注入到两个无菌的试管当中。按照每分钟1500rpm/min离心15min。在细胞接种无菌室分别接种于两个羊水细胞的培养瓶，然后置于培养箱中培养。7d后观察细胞生长情况，根据细胞生长情况进行换液、传代、羊水细胞收获等，然后制片和进行染色体G显带核型分析[16]。

2、产前诊断情况

国内曾经有学者对500例羊水细胞进行一次培养，达到一次培养成功的例数为498例，在整体当中的比例为99.6%，另外的两例在开展第2次培养之后也达到了成功的状态。在研究的过程当中发现孕妇的孕周在16w到22w之间，羊水细胞活性好，羊水细胞易贴壁，可以获得较满意的核型分裂相[17]。在这500例羊水细胞培养操作的过程当中，有8例出现了血样污染的现象，但是对于最终的培养结果却没有产生过于明显的影响。这500例产前诊断羊水染色体核型分析结果中，未发现异常的例数是489例。在对500例抽羊水孕妇随访中，结合母亲有先天愚型生育史的婴儿脐带血分析，没有出现任何一例误诊的现象，由此可见，这样的一种诊断方式在产前诊断当中的准确性是比较高的，这也为这种诊断方式在临床当中的应用和推广提供了现实的依据[18]。

国内曾经有一个医学研究工作室从1982年开始就对羊水染色体核型开展分析工作，在总体的分析成果当中成功率都在99%以上[19]。在这个操作过程当中，成功的关键就在于能够开展严格的无菌操作，同时也注重培养基微酸环境，在换液的过程当中，为结合实际的情况，在细胞收获的过程当中，也注意关注细胞的破坏和丢失状况，对于一些存在这些污染的标本来说也提前进行液体的换取等措施，这样的一种处理方式，能够保证有着较为足够的分裂相开展进一步的分析操作[20]。在多年的研究当中，学者们也总结出来，在条件许可的情况下，尽可能会在孕妇怀孕18周到22周之间对羊水进行抽取，同时开展染色体核型的分析工作[21]。

实际上自从1956年羊膜腔穿刺术问世以来，羊水胎儿的细胞培养以及相关的染色体核型分析已经成为目前在医学临床当中应用最为广泛，也是最可靠的一种产前诊断方法，通过这种方式能够对一系列的胎儿异常疾病开展进一步的诊断和分析工作，诊断的内容包括着染色体数目的异常，同时也能够分析其中存在的重复和易位的问题，对于缺失和畸形胎儿也能够进行及时的诊断[22]。可以说这样的一种诊断方法和技术是目前细胞遗传学诊断方面的一个金标准，我国很多医院在开展羊水诊断以来，在长年的经验积累过程当中，在多年的操作和管理工作不断改进的过程当中，都已经建立了比较稳定的羊水细胞培养制备技术，同时也成功对多名中孕期的待检者开展胎儿染色体方面的诊断，能够在我国优生优育工作开展当中提供具有针对性的数据支持和参考[23]。国内的学者在一次研究当中对619例孕妇进行羊水的抽取，羊水的抽取量最少为15ml，最多为25ml，平均的量控制在20ml左右，同时羊水细胞的培养时间控制在7～10d之间，平均的时间控制在8.5d左右，对于传代的培养者来说，再加上2～5d的处理时间[24]。在羊膜穿刺的孕妇当中，没有发现存在着羊水栓塞的现象，同时也不存在着胎盘剥离或者胎儿受到损伤感染的一些严重的并发症，这619例患者的羊水细胞都达到了培养成功的状态，再进一步的核型分析过程当中，有24例出现了染色体异常的情况。在这个过程当中发现的14例三体、单体或者多倍体胎儿，在获得当事人的同意之后，最终进行了终止妊娠[25]。

通过羊膜腔穿刺可以获得羊水细胞，最终进行胎儿染色体的核型分析，这也是目前产前诊断非常重要的方法之一，这种方式是比较安全。如果羊水细胞培养失败或者收获之后的技术分析不够，在这种情况下还需要孕妇进行第2次羊膜腔穿刺，对于孕妇来说是较难以接受，同时她们的孕周也超过了相应的孕周，因此需要确保羊水细胞培养的成功率[26]。在实际操作的过程当中，可以使用细胞传代培养的方法，使得羊水细胞培养的成功率得到保证。对于传代培养细胞贴壁来说，通常情况下会比原代细胞迟1～2d左右，而且自身的生长较为旺盛，细胞能够均匀的附着在瓶子的底部当中，在收获前的一天，可以进行培养液的更换，进一步使得细胞分裂获得有效的促进，最终在这个过程当中获得较为丰富的中期分裂相，保证整体结果的正确性[27]。这样的一种操作方法，整体的简便性和成功率也比较突出。对于原代细胞培养来说，往往细胞的生长周期都不是特别理想，过分细胞克隆生长过老有可能会出现接触方面的抑制现象，这种情况的存在会出现染色体分析技术不够的情况，因此在复核的过程当中可以使用传代细胞培养技术来进行操作。当然是细胞传代培养达到5～6d左右的时候，细胞通常下已经大量的到达贴壁的效果。在通常情况之下，传代细胞分散和铺展的效果要比原代细胞理想，同时自身的生长也比较旺盛，细胞的程度比较高，因此这样的一种过程可以获得比较多的细胞，一般来说在更换液体后的第2天就能够收获相应的结果[28]。

根据临床医学当中的研究数据统计可以发现新生儿染色体异常的发生概率在0.47%～0.84%这个区间之间。临床当中比较常见的染色体数目异常主要有四种类型，分别是21三体、18三体、13三体和性染色体异常[29]。对于常染色体来说，非整倍体或者不平衡的一些染色体结构的重新排列患者，他们在新生儿期会出现较为明显临床表现，因此在出生的时候会更加容易检测出这种方面的情况，也能够更加容易获得相应的诊断。三倍体的发生很有可能是起源于人体当中一个具备正常单倍体的精子，但是这个精子会同一个具有异常二倍体的卵子之间进行受精，，或者也有可能是因为双雄受精的现象导致这种情况的出现。对于X核型来说，有些会通过B超发现胎儿存在着全身皮肤水肿的现象，此时可以立即开展羊膜穿刺或者羊水细胞染色体的核型分析，开展针对性的干预和处理工作[30]。

五、未来发展和期望

羊水细胞染色体分析技术是产前诊断染色体疾病当中主要的一种方法，由于羊水细胞的培养对于技术方面的要求比较高，同时自身的难度比较大，需要的培养时间过长，存在着容易污染和分裂相对比较少的问题，因此，很多医疗单位在产前诊断的过程当中，都没有能够开展关于羊水细胞方面的检测工作[31]。多年以来，随着世界各地对于羊水细胞的培养以及这种技术在染色体制片当中的不断改进，在相关的技术成果上获得了进一步的突破，但是羊水细胞培养和染色体制片之间依然存在着一定的难度[32]。近些年来医学研究者不断针对羊水细胞培养技术开展进一步的探索和改良，通过新的技术减少细胞的大量丢失，同时也能够获得更加有效的细胞克隆，使得培养的成功率得到提升[33]。在这方面的技术当中，把羊水细胞液直接作用在培养瓶的底部开展相应的培养，就是其中的典型代表，当然这方面的技术需要以的膜腔穿刺术抽取羊水作为技术的基础和前提[34]。

六、结语

综上所述，经过众多学者的研究，羊水细胞培养可以对胎儿羊水细胞染色体是否存在数目异常或结构异常作出明确的诊断，因此，羊水细胞培养染色体核型分析技术在产前诊断中具有较高的应用价值，对染色体疾病早发现、早诊断、早干预、早治疗，从而提高人口出生素质，达到优生优育的目的。

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基金项目：贵港市科技局科研项目（贵科攻1302004）。